胰腺干細胞和胰島細胞在糖尿病大鼠治療中的療效觀察*

劉智偉，張沖，王進，呂偉，周丁華

（1.錦州醫科大學 火箭軍特色醫學中心研究生培養基地，遼寧 錦州 121001；2.中國 人民解放軍火箭軍特色醫學中心 肝膽外科，北京 100088）

1型糖尿?。╰ype-1 diabetes mellitus, T1DM）是機體接觸病毒、藥物及化學物質后由淋巴細胞介導的自身免疫性疾病。臨床以免疫性胰島炎、胰島β細胞永久損傷、胰島素絕對缺乏和糖代謝失調為特點[1]。有統計顯示，我國＜14歲兒童T1DM年均發病例數從0.51/10萬躍升至1.93/10萬[2]。1/3患者治療不理想，嚴重低血糖、糖尿病酮癥酸中毒及糖尿病腎病等并發癥發病率升高。注射外源性胰島素是T1DM基本治療方法，但不能模擬正常的胰島素分泌方式。胰島細胞移植作為胰島β細胞替代療法，可在體內釋放胰島素降低血糖，但臨床應用存在供體短缺、免疫排斥及移植物存活時間短等問題[3]。因此，T1DM需要一種長期、穩定且安全的治療方法。干細胞作為一類特殊細胞，在體內具有增殖、分化和自我更新的潛能。最新研究指出，胰腺干細胞可在體外誘導分化為胰島β細胞，并且能夠形成分泌胰島素的類胰島細胞團[4]。本研究將體外培養分化的胰腺干細胞與胰島細胞移植在糖尿病大鼠的門靜脈內，以探討胰腺干細胞的降糖療效與應用價值，為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

1.2 實驗試劑和儀器

鏈脲菌素（Streptozotocin, STZ）、膠原酶V、D-Hank's、RPMI 1640、DMEM/F12及胰島素-轉鐵蛋白-硒均購自美國Sigma公司，Percoll分離液購自美國GE Healthcare公司，他克莫司購自日本Fujisawa株式會社，超凈工作臺、離心機購自美國Sigma公司，顯微鏡購自日本Olympus株式會社，血糖儀及試紙購自瑞士羅氏公司，手術器械購自上海醫療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糖尿病大鼠模型的復制及分組實驗組大鼠禁食24 h后，采用1% STZ溶液（60 mg/kg）腹腔注射復制T1DM模型。模型復制成功標準：非禁食狀態下大鼠尾靜脈血糖≥16.7 mmol/L，維持2 d并出現多飲、多食、多尿和體重降低等癥狀[5]。將模型鼠隨機分為胰島細胞組和胰腺干細胞組，每組30只。

1.3.2 胰腺干細胞分離與鑒定采用20%烏拉坦（5 ml/kg）腹腔注射麻醉供體組大鼠，膠原酶V逆行灌注消化大鼠胰腺，收集細胞懸液置于不同密度的Percoll梯度離心管，1 500 r/min離心20 min，收集1.096/1.068界面細胞并加入到含10%胎牛血清的RPMI 1640培養瓶中，37℃、5%二氧化碳CO2條件下培養，胰腺干細胞分離完成[6]。培養7 d后，改用含10%胎牛血清，20 ng/ml表皮生長因子，20 ng/ml堿性成纖維生長因子，1 mmol/L丙酮酸鈉，71.5μmol/L β-巰基乙醇，10 mmol/L HEPES，0.1 g/L鏈霉素及 100 u/ml青霉素的RPMI 1640培養基進行細胞擴增[7]。使用免疫熒光法檢測胰腺干細胞CK19蛋白的表達。

1.3.3 胰腺干細胞誘導分化將擴增的胰腺干細胞換用含2 g/L牛血清白蛋白，10μg/L肝細胞生長因子，10 mmol/L尼克酰胺，8 mmol/L葡萄糖，1 g/L胰島素-轉鐵蛋白-硒，0.1 g/L鏈霉素及100 u/ml青霉素的無血清DMEM/F12培養液進行誘導分化[8]。4周后在倒置顯微鏡下采用血球計數板計數類胰島細胞團，細胞直徑＞ 150μm為1個胰島當量（IEQ），DTZ染色后計算類胰島細胞純度，類胰島細胞純度=DTZ陽性細胞數/細胞總數×100%；AO/PI染色計算類胰島細胞存活率，類胰島細胞存活率=AO陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.3.4 胰島細胞分離與純化參照胰腺干細胞分離方法收集供體組成年大鼠胰腺細胞懸液，隨后置于Percoll梯度離心管，收集1.118/1.096界面細胞[6]。將細胞移入RPMI 1640培養瓶，37℃、5% CO2條件下培養，計算每只供體可獲取的胰島細胞Q、胰島細胞純度及胰島細胞存活率。

1.3.5 移植實驗組大鼠麻醉成功后，取腹部正中切口，分離胃結腸韌帶，暴露門靜脈，用1 ml注射器針頭穿刺門靜脈分支處，胰島細胞組緩慢推注胰島細胞800 IEQ，胰腺干細胞組推注等量類胰島細胞（見圖1）。移植后，輕壓穿刺點至無出血、滲出后逐層關閉腹腔。兩組大鼠術后3 d肌內注射青霉素鈉（0.12 g/ml）抗感染治療；腹腔注射他克莫司1 mg/（kg·d）[9]。各組大鼠術后自由進食進水。

圖1 移植物經門靜脈移植

1.4 觀察指標

1.4.1 體外胰島素倒置顯微鏡下挑選類胰島細胞團和胰島細胞團，并分別接種于6孔板，每孔100 IEQ，每孔含5.5 mmol/L葡萄糖的無血清RPMI 1640培養液（基礎相），37℃孵育2 h；換用含25 mmol/L葡萄糖的無血清RPMI 1640培養液（高糖相），37℃孵育2 h，收集培養液上清用放射免疫法測定胰島素水平，每孔重復5次。

1.4.2 血糖和胰島素水平術前3 d及術后1周每天監測兩組大鼠血糖水平；術后2～13周監測隨機血糖，3 d/次。移植物功能正常標準：連續2 d非空腹血糖＜11.10 mmol/L；移植物功能失活標準：隨機血糖＞16.70 mmol/L，記錄失活時間[10]。術前1 d及術后每7天檢測血胰島素水平。

為探究民俗“祝?！痹诼糜尉皡^的文化展示，筆者以一名普通游客的身份對魯迅故里的“祝?！眱x式進行了實地考察，下文即為參觀見聞。

1.4.3 高糖刺激實驗術后15和65 d高糖刺激實驗檢測大鼠刺激前后血清C肽水平，兩組大鼠禁食14 h后，尾靜脈取血，采用放射免疫法測定刺激前血清C肽水平；兩組大鼠50%葡萄糖溶液（10 ml/kg）灌胃，10 min后復測血清C肽水平。

1.4.4 腹腔葡萄糖耐量功能術后19 d行腹腔葡萄糖糖耐量實驗。兩組大鼠禁食14 h后，每只大鼠腹腔注射50%葡萄糖溶液4 ml/kg，測定注射后0、5、10、15、30、45、60、90及120 min血糖。

1.4.5 組織病理學兩組術后58 d各隨機處死1只大鼠，取肝臟組織行HE和免疫組織化學染色，觀察標本組織形態和移植物活性。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或重復測量設計的方差分析；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物情況

胰腺干細胞組1只大鼠于術后17 d死亡，胰島細胞組3只大鼠分別于術后15、53及61 d死亡，兩組術后58 d各隨機處死1只大鼠行病理學觀察。最終，胰腺干細胞組和胰島細胞組分別有28和26只大鼠納入本實驗。

2.2 兩組胰島素釋放水平比較

胰島細胞組基礎相胰島素為（7.79±0.52）mIU/L， 高糖相為（21.54±2.25）mIU/L，經配對t檢驗，差異有統計學意義（t=34.778，P=0.000）。胰腺干細胞組誘導分化形成的類胰島細胞基礎相胰島素為（2.49±0.42）mIU/L，高糖相為（6.61±1.06）mIU/L， 經配對t檢驗，差異有統計學意義（t=24.967，P=0.000），表明移植物均有分泌胰島素的功能。見圖2。

2.3 移植物計數、純度及活性

免疫熒光染色結果顯示，胰腺干細胞呈長梭形，細胞膜表面CK-19蛋白染色陽性，陽性率為（89.27±3.86）%（見圖3A）。類胰島細胞經DTZ染色后呈猩紅色，非胰島細胞不顯色（見圖3B）。AO/PI 染色后經熒光顯微鏡觀察，正常細胞呈綠色熒光，凋亡或壞死細胞呈紅色或強紅色熒光（見圖3C）。每只新生大鼠胰腺干細胞經分化后可獲取類胰島細胞團（264.46±29.61）IEQ，類胰島細胞團純度為（75.72±4.92）%，存活率為（91.02±3.03）%。每只成年大鼠可獲取胰島細胞（386.87±38.59）IEQ，胰島細胞純度為（90.11±3.39）%，存活率為（91.32±2.55）%。

圖2 兩組胰島素釋放水平比較 （n =30，±s）

圖3 移植物形態

2.4 兩組大鼠移植前后血糖水平比較

兩組大鼠移植前1 d血糖水平比較，差異無統計學意義（t=-0.515，P=0.609），且兩組大鼠血糖均≥ 16.7 mmol/L。胰島細胞組大鼠血糖在移植后3 d恢復正常，胰腺干細胞組大鼠血糖移植后5 d恢復正常，兩組分別與移植前1 d比較，經獨立樣本t檢驗，差異有統計學意義（t=31.144和38.135，均P=0.000）。

兩組移植后不同時間點大鼠血糖水平比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的血糖水平有差異（F=241.148，P=0.000）； ②兩組大鼠血糖水平有差異（F=43.758，P=0.000）； ③兩組大鼠血糖水平變化趨勢有差異（F=30.046，P=0.000）。胰島細胞組大鼠移植后85 d與移植前2 d血糖水平比較，經配對樣本t檢驗，差異無統計學意義（t=2.019，P=0.054）；胰腺干細胞組大鼠移植后85 d與移植前2 d血糖水平比較，經配對樣本t檢驗，差異有統計學意義（t=14.106，P=0.000）。見表1和圖4。

2.5 兩組大鼠移植前后胰島素水平比較

兩組大鼠移植前1 d胰島素水平比較，經獨立樣本t檢驗，差異無統計學意義（t=0.477，P=0.636）。胰島細胞組和胰腺干細胞組大鼠移植后7 d與移植前1 d胰島素水平比較，差異有統計學意義（t=-19.380和-21.205，均P=0.000），移植后7 d較移植前高。

兩組大鼠移植后不同時間點大鼠胰島素水平比較，經重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的胰島素水平有差異（F=125.119，P=0.000）；②兩組 大鼠胰島素水平有差異（F=22.314，P=0.000）；③兩組 大鼠胰島素水平變化趨勢有差異（F=34.032，P=0.000）。胰島細胞組移植后70 d與移植前1 d胰島素水平比較，經配對樣本t檢驗，差異無統計學意義（t=-0.673，P=0.507）；胰腺干細胞組移植后70 d與移植前1 d胰島素水平比較，經配對樣本t檢驗，差異有統計學意義（t=-10.115，P=0.000）。見表2。

表1 兩組大鼠移植前后血糖水平比較 （mmol/L，±s）

表1 兩組大鼠移植前后血糖水平比較 （mmol/L，±s）

組別 n 移植前2 d 移植前1 d 移植后1 d 移植后3 d 移植后5 d胰島細胞組 26 23.18±1.14 24.02±1.81 19.91±2.01 10.95±1.48 8.07±1.28胰腺干細胞組 28 23.93±1.48 24.23±1.36 21.83±1.42 16.36±1.24 10.92±0.91組別 n 移植后7 d 移植后13 d 移植后19 d 移植后25 d 移植后31 d胰島細胞組 26 6.85±1.08 7.50±1.03 7.16±1.01 6.60±0.91 7.30±0.98胰腺干細胞組 28 7.86±0.89 6.73±0.94 7.34±0.45 7.28±1.11 6.85±0.96組別 n 移植后37 d 移植后43 d 移植后49 d 移植后55 d 移植后61 d胰島細胞組 26 7.02±1.65 8.13±2.25 8.43±2.99 9.87±3.30 11.74±3.53胰腺干細胞組 28 7.56±1.05 7.65±1.20 7.17±1.88 8.43±2.46 6.94±2.61組別 n 移植后67 d 移植后73 d 移植后79 d 移植后85 d 移植后91 d胰島細胞組 26 15.42±3.02 17.43±1.79 19.17±2.95 21.43±4.32 22.67±3.64胰腺干細胞組 28 10.52±2.41 10.10±3.18 12.56±3.78 14.20±3.74 14.79±3.93

圖4 兩組大鼠移植前后血糖變化趨勢

表2 兩組大鼠移植前后胰島素水平比較 （mIU/L，±s）

表2 兩組大鼠移植前后胰島素水平比較 （mIU/L，±s）

組別 n 移植前1 d 移植后7 d 移植后14 d 移植后21 d 移植后28 d胰島細胞組 26 11.57±0.86 21.95±2.63 20.91±2.10 20.61±2.14 21.15±1.78胰腺干細胞組 28 11.46±0.78 18.57±1.57 21.00±1.84 19.64±1.58 22.05±1.70組別 n 移植后42 d 移植后56 d 移植后70 d 移植后84 d 移植后91 d胰島細胞組 26 20.51±2.51 15.75±2.91 11.94±2.69 11.33±3.13 9.57±2.79胰腺干細胞組 28 20.48±1.64 20.31±2.59 17.63±3.06 14.39±4.08 13.47±3.95

2.6 兩組大鼠術后不同時間高糖刺激前后C肽水平比較

術后15 d，兩組大鼠高糖刺激前血清C肽水平比較，經獨立樣本t檢驗，差異無統計學意義（P＞0.05）；高糖刺激后兩組C肽水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。術后15 d，兩組大鼠高糖刺激前后血清C肽水平比較，經配對樣本t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），刺激后升高，提示各組移植物功能正常。見表3和圖5A。

術后65 d，兩組大鼠刺激前血清C肽水平比較，經獨立樣本t檢驗，差異無統計學意義（P＞0.05）；高糖刺激后兩組血清C肽水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。術后65 d，兩組大鼠刺激前后血清C肽水平比較，經配對樣本t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），提示各組移植物功能正常。見表3和圖5B。

表3 兩組大鼠術后不同時間高糖刺激前后C肽水平比較 （ng/ml，±s）

表3 兩組大鼠術后不同時間高糖刺激前后C肽水平比較 （ng/ml，±s）

組別 n術后15 d t值 P值術后65 d t值 P值刺激前 刺激后 刺激前 刺激后胰島細胞組 26 0.225±0.043 0.934±0.053 -56.732 0.000 0.205±0.036 0.557±0.161 -11.118 0.000胰腺干細胞組 28 0.209±0.037 0.874±0.149 -22.836 0.000 0.223±0.037 0.801±0.149 -19.657 0.000 t值 1.397 1.931 -1.797 -5.799 P值 0.168 0.059 0.078 0.000

圖5 兩組大鼠術后不同時間高糖刺激前后C肽水平比較 （±s）

2.7 兩組大鼠腹腔葡萄糖耐量實驗的血糖水平 比較

兩組大鼠血糖水平在腹腔注射葡萄糖15 min達到峰值，隨后平穩下降，直至正常水平。兩組不同時間點血糖水平比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的血糖水平有差異（F=1 114.507，P=0.000）；②兩組大鼠血糖水平有差異（F=3.939，P=0.002）；③兩組大鼠血糖水平變化趨勢有差異（F=66.721，P=0.000）。兩組大鼠120 min的血糖水平比較，經獨立樣本t檢驗，差異無統計學意義（t=-0.873，P=0.386）。表明各組大鼠移植物功能良好。見表4和 圖6。

表4 兩組大鼠腹腔葡萄糖耐量實驗的血糖水平比較 （mmol/L，±s）

表4 兩組大鼠腹腔葡萄糖耐量實驗的血糖水平比較 （mmol/L，±s）

組別 n 0 min 5 min 10 min 15 min 30 min胰島細胞組 26 5.36±0.57 10.66±1.25 12.33±0.81 14.37±0.58 12.65±0.67胰腺干細胞組 28 5.67±0.46 11.32±0.94 13.02±0.75 15.19±0.41 13.73±0.60組別 n 45 min 60 min 90 min 120 min胰島細胞組 26 11.04±0.59 9.22±0.70 8.08±0.72 6.32±0.55胰腺干細胞組 28 12.25±0.76 9.54±0.65 8.39±0.78 6.46±0.57

圖6 兩組大鼠腹腔葡萄糖耐量實驗的血糖水平變化趨勢

2.8 兩組移植物存活時間及生存率比較

胰島細胞組移植物平均生存時間（70.12± 2.39） d，中位生存時間73 d；胰腺干細胞組移植物平均生存時間（83.82±1.79） d，中位生存時間為88 d。胰島細胞組和胰腺干細胞組存活率分別為11.54%和50.00%。經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=18.301，P=0.000）。見圖7。

2.9 兩組移植物組織形態學變化

兩組大鼠移植部位標本經HE染色顯示肝臟門靜脈匯管區有新生血管包繞的胰島細胞團，經免疫組織 化學染色顯示細胞團胰島素陽性，細胞狀態良好。見圖8。

圖7 兩組移植物的生存曲線

圖8 大鼠移植物HE染色和免疫組織化學染色 （×20）

3 討論

目前，T1DM治療的方法有外源胰島素注射、胰腺移植、胰島細胞移植和胰腺干細胞移植。外源性胰島素注射難以模擬正常的胰島素分泌方式，同時胰腺供體的缺乏也制約著胰島移植的發展[11]。由于干細胞具有定向分化和自我增殖的潛能，在體外經誘導分化能獲取相應的成體細胞，從而解決胰島細胞不足的問題；同時，將胰島細胞移植到門靜脈符合胰島素生理分泌途徑，可以較好地控制血糖[12]。

本研究從新生SD大鼠胰腺提取CK-19陽性的胰腺干細胞，經Bonner-Weir方法誘導形成類胰島細胞團[8，13]。體外胰島素高糖刺激實驗表明2種細胞均能釋放胰島素，但分化后的類胰島細胞胰島素釋放量低于胰島細胞。有研究表明，體外胰腺干細胞分化形成的類胰島細胞成熟度較天然胰島細胞低[14]。本研究中血糖監測結果表明，胰島細胞組在術后3 d即恢復正常血糖，胰腺干細胞組在術后5 d血糖降至正常水平，術后13 d血糖相對穩定，提示分化后的類胰島細胞在術后早期的降糖作用弱于胰島細胞。監測體內胰島素水平進一步發現，胰腺干細胞組的胰島素分泌量在早期低于胰島細胞組，但是，隨著類胰島細胞在體內的進一步分化成熟，兩組胰島素分泌量相近；在移植晚期，胰腺干細胞組胰島素分泌量高于胰島細胞組。結合KIM等[15]的研究認為，胰腺干細胞的分化、發育受其所處環境及供體內生長因子調控，并在受體內進一步分化成為功能成熟的胰島細胞。

本研究中高糖刺激實驗表明，各組大鼠刺激前后C肽水平有差異，表明各組移植物內分泌功能正常。C肽和胰島素由胰島β細胞等量分泌至體循環。相較于單一使用外源胰島素，胰腺或胰島移植可使內源性胰島素和C肽恢復，并改善糖尿病腎病進展[16]。行腹腔葡萄糖耐量實驗2 h后，大鼠血糖均降至正常水平，表明各組大鼠移植物功能正常。

本研究顯示，大鼠使用他克莫司后移植物平均存活時間（83.82±1.79） d，較本課題組未使用免疫抑制的移植實驗平均存活時間長[17]。同種異體胰島細胞移植后受體均會不可避免地發生免疫排斥反應，而免疫抑制劑能不同程度地抑制T細胞增殖，從而減少免疫排斥反應，延長移植物存活時間[18]。雖然他克莫司和西羅莫司對人胰島細胞產生毒性作用，但短時間應用糖皮質激素能有效減少炎癥反應。因此，免疫抑制劑的用量及類型仍需進一步探究。

綜上所述，本實驗結果顯示胰腺干細胞體外誘導分化并經門靜脈移植可有效降低糖尿病大鼠血糖，移植物存活時間長，療效優于胰島細胞。胰腺干細胞可作為胰島細胞移植治療T1DM的新替代方案。此外，還可進一步改善胰腺干細胞體外誘導方案，促進胰島細胞體外成熟度，并結合生物支架提高移植療效。