血管內皮生長因子促進根尖周囊腫骨吸收

劉春燕 張旗

根尖周囊腫是頜骨內常見的牙源性囊腫，約占牙源性囊腫發病率的54.6%[1]。根尖周囊腫多由根管內或根尖周部位的感染造成根尖區炎癥及免疫反應，最終導致頜骨組織的吸收破壞[2]。在炎癥導致的骨吸收過程中，血管的增生有利于釋放細胞因子和炎癥介質，募集炎癥細胞及破骨細胞前體，從不同方面參與骨吸收過程[3]，提示血管生長與骨破壞密切相關。根尖周囊腫長期處于慢性炎癥刺激下，囊壁中毛細血管大量增生，調控其血管的生長可能影響其骨吸收，但血管增生在其骨破壞過程中的作用尚未明確。

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種強有力的促內皮細胞有絲分裂因子，通過影響內皮細胞的增殖、分化和遷移調控血管生長[4]。VEGF能夠增加血管通透性，促進血漿蛋白滲出，造成炎癥組織水腫[5]。同時，VEGF還具有單核細胞趨化功能，促進破骨細胞前體滲出并聚集于局部組織[6]；也有研究表明VEGF與M-CSF作用相似，可直接促進破骨細胞的分化與成熟[7]。已有學者證實VEGF在根尖周囊腫中高表達[8]，但其在根尖周囊腫骨吸收過程中的作用有待進一步探討。

本研究探討根尖周囊腫骨破壞與血管增生之間的相關性，同時闡釋VEGF在囊腫血管化與骨破壞過程中扮演的角色。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

根尖周囊腫標本(同濟大學附屬口腔醫院口腔頜面外科)；酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒、VEGF抗體(武漢博士德)；CD34抗體(Abcam，美國)；二抗及DAB顯色液(北京中杉金橋)；α-MEM培養基(Gibco，美國)；胎牛血清(Excel，澳洲);RANKL(R&D，美國)，小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7(ATCC?SC-6003)、貝伐單抗(Genentech Inc.,USA)；I型膠原酶、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)試劑盒(Sigma，美國)；Trizol Reagent、逆轉錄試劑盒(Life Technologies，美國)；SYBR GREEN(Roche，瑞士)。

1.2 病例收集

收集2016 年9 月～2017 年12 月同濟大學附屬口腔醫院口腔頜面外科經根尖手術切除的根尖周囊腫病例32 例，納入標準為：由復旦大學腫瘤醫院病理科根據臨床特征、影像學及病理信息診斷為根尖周囊腫；全景片顯示根尖周囊腫邊界清晰；病歷信息完整(包括姓名、性別、年齡、及影像學信息等)； 3 個月內未服用抗生素和其他激素類藥物；無全身系統性疾病。選取6 例正頜手術患者頜骨骨松質，提取骨髓間充質成纖維細胞作為對照組。本實驗已獲得患者知情同意，并取得同濟大學倫理委員會批準同意。

1.3 HE染色及骨破壞面積測量

根尖周囊腫石蠟標本切片4 μm厚，常規脫蠟、水化后， HE染色觀察。使用Image-Pro Plus 6.0測量全景片中根尖周囊腫低密度影像面積作為其骨破壞面積。

1.4 免疫組織化學染色

根尖周囊腫石蠟標本切片4 μm厚，常規脫蠟、水化后，以鼠抗人CD34抗體(1∶500)、鼠抗人VEGF抗體(1∶200)4 ℃過夜孵育，羊抗鼠生物素標記二抗(1∶200) 37 ℃孵育1 h， DAB顯色，常規脫水、透明、封片[9]。使用PBS代替一抗作為陰性對照。隨機選取5 個400 倍鏡下視野，Image-Pro Plus 6.0測量血管腔面積，每個視野下血管面積之和計為微血管密度。VEGF表達量采用累積光密度(IOD)計算染色強度[10]。

1.5 細胞培養

酶消化法與組織塊法分離提取14 例根尖周囊腫囊壁成纖維細胞和6 例頜骨骨髓間充質成纖維細胞，原代培養于α-MEM[含1%雙抗(青霉素100 U/ml， 鏈霉素100 U/ml)， 2 mmol/L L-谷氨酰胺，10% 胎牛血清]中。于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。

1.6 ELISA及RT-qPCR

酶聯免疫吸附反應檢測(ELISA)：取實驗組與對照組P3代細胞的培養上清，用酶聯免疫吸附反應雙抗夾心法檢測上清中VEGF的含量，嚴格按照試劑盒說明操作。實時熒光定量PCR(RT-qPCR)：收集兩組P3代細胞，加入Trizol裂解液，提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA后進行定量PCR。引物設計如下：VEGF：5′-TTATGCGGATCAAACCTCACC-3′，5′-GAAGCTCAT-CTCTCCTATGTGC-3′； β-actin： 5′-CATGTACGGTTGCTATCCAGGC-3′，5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。

1.7 制備條件培養基和誘導RAW264.7破骨向分化

將實驗組與對照組細胞接種于100 mm培養皿，當細胞達到70%～80%匯合時，更換無血清α-MEM培養基培養7 d， 550 g離心10 min，棄沉淀后，取50%上清、40%新鮮α-MEM、10% FBS和20 ng/μl RANKL混合制備條件培養基。實驗組條件培養基一式兩份，其中一份加入貝伐單抗作為加藥組。Raw264.7細胞以每孔1 000 個細胞接種于24 孔板， 3 組條件培養基分別誘導，每2 天換液至第10天。 TRAP染色，計數破骨細胞，僅TRAP陽性且細胞核≥3 個的細胞計為破骨細胞。

1.8 統計分析

2 結 果

2.1 根尖周囊腫HE染色及影像學表現

本實驗所有病例均表現出典型的根尖周囊腫特點，HE染色顯示囊腫纖維囊壁內襯復層鱗狀上皮，上皮釘突發生不規則增生、伸長，相互融合成網狀，纖維囊壁內富含膠原纖維，可見較多慢性炎癥細胞浸潤。影像學表現為圍繞根尖的圓形或橢圓形低密度透射影像，周圍偶有密度增高的骨白線(圖1)。

圖1 根尖周囊腫HE染色(A～B)及影像學表現(C) (A: ×40; B: ×200)

2.2 根尖周囊腫骨破壞面積與VEGF的表達及微血管密度成正相關

VEGF在根尖周囊腫的上皮細胞，成纖維細胞、血管內皮細胞、炎癥細胞及細胞外基質中呈陽性表達。CD34陽性的內皮細胞包繞形成的微血管廣泛分布于囊壁間質中(圖2)。卡方檢驗結果表明根尖周囊腫骨破壞面積與年齡、性別、部位等無關，但與VEGF的表達以及微血管密度成正相關(P<0.05)(表1)。

圖2 根尖周囊腫VEGF及血管免疫組織化學染色 (A、C： ×100； B、D： ×400)

表1 骨破壞面積與臨床病理特征的聯系 [n(%)]

2.3 根尖周囊腫囊壁成纖維細胞較對照組VEGF表達增高

RT-qPCR檢測根尖周囊腫囊壁成纖維細胞及頜骨骨髓間充質成纖維細胞中VEGF的含量，結果顯示實驗組較對照組VEGF的表達顯著增多(P<0.05)。ELSA檢測上述2 組細胞培養上清中的VEGF蛋白含量，結果顯示實驗組細胞較對照組分泌更多的VEGF，差異具有統計學意義(P<0.05)(圖3)。

圖3 VEGF在實驗組與對照組中的表達

2.4 根尖周囊腫囊壁成纖維細胞分泌的VEGF能有效促進破骨細胞分化

收集上述2 組細胞培養液上清，制備條件培養基，誘導細胞系RAW264.7破骨向分化，結果表明實驗組破骨細胞分化效率顯著高于對照組(P<0.05)。在根尖周囊腫組條件培養基中加入貝伐單抗抑制VEGF后，其破骨細胞誘導效率顯著下降(P<0.05)，如圖4所示。

A： 對照組(×400)； B： 實驗組(×400)； C： 加藥組 (×400)

3 討 論

根尖周囊腫一般經歷根尖周組織炎癥反應、馬拉瑟上皮剩余增殖、液化壞死囊性變等一系列病理過程，造成頜骨組織破壞[11]。骨質破壞范圍較大時可引起病理性骨折，但其骨破壞機制尚未明確。Zizzi等[12]研究發現囊腫中微血管密度增加、炎癥浸潤程度增強、炎性蛋白滲出可能造成組織水腫，對頜骨產生壓迫性骨吸收。也有研究表明VEGF在慢性根尖周炎過程中表達增多，促進血管增生及血管通透性增加[13]，但他們并未直接證實囊腫中血管增生及VEGF的表達與骨破壞之間的相關性，以及VEGF對破骨細胞的直接作用。因此本研究將從這兩方面對VEGF在根尖周囊腫骨破壞過程中的作用進行探討。

本研究通過免疫組織化學染色方法顯示VEGF在根尖周囊腫囊壁成纖維細胞、炎癥細胞以及細胞外基質中均有表達，微血管廣泛分布于囊壁間質中。根尖周囊腫的骨破壞面積與囊壁中微血管密度、VEGF的表達強度成正相關。此結果表明囊腫中高表達的VEGF可通過促進血管的增生從而增加其骨吸收功能。這與前人的研究結果一致[13-14]，Graziani等[15]研究證實根尖周囊腫囊壁間質較上皮表達更高的VEGF，且其表達強度與微血管數目相關，后者與炎癥浸潤程度相關。提示血管化在炎癥導致的骨吸收過程中的重要作用。而VEGF則能通過促進血管生長，增加血管通透性，從而使血漿蛋白滲出，囊液聚集，囊內壓力增加，進而促進囊腫擴大對頜骨產生壓迫性骨吸收[8,12,16]。

骨組織的破壞由破骨細胞所介導，破骨細胞表面表達VEGF受體，VEGF與其受體結合后能夠直接激活破骨細胞，促進其成熟、分化并發揮骨吸收活性[17]。為進一步探究VEGF對破骨細胞的作用，本實驗分離培養了根尖周囊腫囊壁成纖維細胞，與頜骨骨髓間充質成纖維細胞對比，發現其較對照組高表達VEGF，且其破骨細胞誘導效率更高，而在加入貝伐單抗抑制VEGF后破骨細胞誘導效率顯著下降。這說明根尖周囊腫囊壁成纖維細胞所分泌的VEGF能夠有效促進破骨細胞分化。也有研究表明在多種骨吸收疾病中，VEGF作為一種募集破骨細胞前體的重要分子[6]，能夠增加破骨細胞前體從血管中滲出，從而增加局部組織中破骨細胞的來源。VEGF通過影響破骨細胞的來源、分化、成熟及其功能，最終促進骨質吸收破壞[18]。

綜上所述，根尖周囊腫囊壁高表達的VEGF一方面可通過促進血管增生，血管通透性增加，炎癥因子及血漿蛋白滲出，導致囊液聚集，囊腫擴大而產生壓迫性骨吸收；另一方面，VEGF通過募集破骨細胞前體，并直接作用于破骨細胞促進其分化成熟，進一步加劇了根尖周囊腫的骨破壞。VEGF在囊腫骨破壞過程中的重要作用，使得它可能成為臨床上對于根尖周囊腫診斷及治療的一個新靶點，但還需進一步深入研究其中的作用機制。