純鈦表面復(fù)合納米微球涂層的構(gòu)建及其體外釋藥特性研究

程義成 孔祥偉 吳江 尹偉 沈彬 劉向輝

種植體周圍感染是引起種植體失敗的最重要原因之一[1]。牙科種植體是一個穿齦結(jié)構(gòu)，其上部結(jié)構(gòu)暴露在口腔這個復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)中[2]，口內(nèi)的細菌極易黏附于穿齦的基臺表面，并穿過種植體基臺-軟組織的結(jié)合界面進入深層引發(fā)炎癥甚至破壞骨結(jié)合[3]。良好的種植體基臺部軟組織生物學(xué)封閉對于種植體成功率和使用壽命至關(guān)重要。然而臨床常用的光滑基臺難以形成并維持生物學(xué)封閉[4]。針對以上情況，本研究選擇具有明確促進軟組織細胞生長的結(jié)締組織生長因子，制作緩釋納米微球，并通過滲涂交聯(lián)法在純鈦微弧氧化涂層表面構(gòu)建復(fù)合涂層，為下一步應(yīng)用于種植體基臺表面奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

材料：結(jié)締組織生長因子(CTGF)、聚L-乳酸(PLLA，Mw：152 000)、聚乙烯醇(PVA)及明膠(Sigma-Aldrich、美國)；CTGF ELISA試劑盒(Ray Biotech，美國)；β-甘油磷酸二鈉鹽五水(β-GP，國藥集團)；乙酸鈣(CA，天津協(xié)和)；純鈦板(TA2，寶鈦集團)。

儀器：超聲波細胞粉碎儀(JY92-IIN型，寧波新芝)；掃描電子顯微鏡(S-4800型，日立，日本)；激光粒徑分析儀(Mastersizer 2000型，Malvem Instruments，英國)；微弧氧化相關(guān)設(shè)備(西安理工大學(xué)自制)等。

1.2 方法

1.2.1 CTGF/PLLA納米微球的制備 采用復(fù)乳法制備CTGF/PLLA納米微球。將5 mg CTGF溶于0.2 ml去離子水中作為內(nèi)水相；100 mg PLLA溶于2 ml二氯甲烷中作為油相。將內(nèi)水相逐滴加入油相中，在冰水浴中超聲波細胞粉碎儀超聲乳化(功率80 W)1 min形成初乳。再加入10 ml 1%的PVA水溶液，繼續(xù)超聲乳化1 min形成復(fù)乳。以500 r/min轉(zhuǎn)速磁力攪拌12 h后在15 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，分離收集微球，并用蒸餾水洗滌3次，經(jīng)冷凍干燥后得到微球粉末。掃描電鏡觀察微球表面形貌，并應(yīng)用激光粒度分布測試儀測定其粒徑，重復(fù)測定6 次。

1.2.2 微弧氧化涂層(內(nèi)涂層)制備 將純鈦板線切割成方片狀(10 mm×10 mm×2 mm)試樣，耐水砂紙逐級打磨至1200#后拋光。以純鈦片為陽極，不銹鋼鍋為陰極，在含有0.04 mol/L β-GP和0.2 mol/L CA的水溶液中采用脈沖直流電進行微弧氧化處理(電壓300 V，頻率600 Hz，占空比8.0%，處理時間5 min)。拋光純鈦及純鈦微弧氧化涂層試樣均應(yīng)用掃描電鏡觀察表面形貌。

1.2.3 純鈦表面復(fù)合納米微球涂層的構(gòu)建 20 mg CTGF/PLLA納米微球超聲分散于5 ml的0.2%的明膠溶液中。取400 μl 納米微球懸液滴至純鈦微弧氧化涂層試樣表面，在漩渦振蕩器上振蕩1 h后在4 ℃干燥，再將其浸泡于2.5%的戊二醛溶液中30 min，使明膠發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，最后用無水乙醇清洗試樣3 次以除去殘留戊二醛。掃描電鏡觀察涂層表面形貌。

1.2.4 復(fù)合納米微球涂層釋藥特性研究 將制備出來的一片涂層試樣浸入5 ml磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)緩沖液中，再轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)放入盛有20 ml PBS緩沖液的三角燒瓶內(nèi)，密封后置于振蕩培養(yǎng)箱中恒速振蕩(37 ℃，100 r/min)。在預(yù)定的時間點從袋外緩沖液中取樣1 ml，并立即補加等量同質(zhì)同溫PBS。利用ELISA法測定取樣中CTGF含量，從而計算其釋放濃度和累計釋放百分率，重復(fù)該研究6 次，并繪制釋藥曲線。

1.2.5 復(fù)合納米微球涂層降解形貌觀察 按照1.2.4方法將試樣放置于PBS中，分別在1、10、20和30 d時從透析袋里取出試樣，干燥噴金后掃描電鏡觀察涂層降解形貌。

2 結(jié) 果

2.1 CTGF/PLLA納米微球制備

CTGF/PLLA納米微球平均粒徑為(376.5±18.2) nm。掃描電鏡下可見微球呈現(xiàn)良好的球面形態(tài)，表面無明顯粘連和聚合，粒徑分布比較均勻(圖1)。

圖1 納米微球掃描電鏡圖

2.2 微弧氧化涂層

掃描電鏡下觀察可見拋光純鈦試樣表面光滑，微弧氧化處理后在純鈦表面形成了多孔狀涂層，微孔大小不均，其孔徑在1～3 μm之間(圖2)。

圖2 拋光純鈦及微弧氧化涂層掃描電鏡圖

2.3 純鈦表面復(fù)合納米微球涂層

圖3為掃描電鏡下觀察到的純鈦表面復(fù)合納米微球涂層形貌，可見微球主要黏附在微弧氧化涂層的微孔中，通過明膠彼此交聯(lián)并交聯(lián)至微孔壁。

圖3 純鈦表面復(fù)合納米微球涂層掃描電鏡圖

2.4 純鈦表面復(fù)合納米微球涂層釋藥曲線

圖4為復(fù)合納米微球涂層釋藥曲線，可見涂層的釋藥特征表現(xiàn)為少量的初期突釋以及隨后的藥物緩慢釋放的兩相曲線。突釋階段可見14.6%的CTGF在前8 h內(nèi)從該涂層中釋放；而在隨后的30 d里，有71.8%的CTGF從涂層中緩慢釋放。

圖4 純鈦表面復(fù)合納米微球涂層釋藥曲線

2.5 純鈦表面復(fù)合納米微球涂層降解形貌

掃描電鏡下觀察到的涂層降解形貌見圖5。1 d后涂層中微球的變化并不顯著，10 d后可見涂層中的微球出現(xiàn)了少量變形，涂層中微球數(shù)量也少量減少；降解20 d后涂層中微球出現(xiàn)了明顯變形，涂層中微球的數(shù)量明顯減少了；隨著時間的推移，涂層中的微球的形態(tài)變化和數(shù)量減少都更加明顯，在降解30 d后大部分微球已經(jīng)從涂層的微孔中脫落，微弧氧化涂層的微孔中只剩下少量變形了的微球。

圖5 純鈦表面復(fù)合納米微球涂層降解掃描電鏡圖

3 討 論

鈦是目前應(yīng)用最為廣泛的種植體材料，在生理條件下鈦表面會形成一層蛋白層，該蛋白層既利于細胞的黏附，同時也非常適合細菌的黏附[5]。牙科種植體是一個穿齦的結(jié)構(gòu)，口內(nèi)的細菌會通過種植體基臺與軟組織結(jié)合的部位侵入引發(fā)感染甚至破壞下方的骨結(jié)合[6]。因此，在種植體基臺部盡快形成一個穩(wěn)定、有效的軟組織生物學(xué)封閉是提高種植體成功率和使用壽命的關(guān)鍵問題之一。然而目前臨床常用的光滑基臺難以形成并維持生物學(xué)封閉[7]。近年來種植體基臺表面加載生物活性因子的涂層逐漸成為了研究的熱點[8]。本研究選擇了CTGF來制備涂層，CTGF具有顯著促進成纖維細胞黏附和增殖作用[9]，并且CTGF在低濃度時仍能發(fā)揮生物學(xué)功能。

微弧氧化是一種常用的金屬表面改性技術(shù)，可以在鈦表面形成多孔狀涂層[10]。在含有鈣和磷的電解液中處理，還能將鈣和磷元素引入到涂層中從而增加其生物活性[11]。同時，微弧氧化涂層多孔狀的結(jié)構(gòu)也給載藥微球的黏附提供了空間[12]。在本研究中，純鈦在微弧氧化后形成了孔徑1～3 μm的多孔狀涂層，而制備出來的CTGF/PLLA納米微球平均粒徑為376.5 nm，遠小于微孔孔徑，給復(fù)合納米微球涂層的構(gòu)建提供了可能。構(gòu)建出來的涂層經(jīng)掃描電鏡觀察微球主要集中在微弧氧化的微孔中，通過明膠彼此交聯(lián)至微孔壁。通過物理嵌合和化學(xué)交聯(lián)2 種方式有效防止載藥微球從純鈦表面脫落。

將CTGF制備成載藥微球并交聯(lián)至微弧氧化純鈦表面構(gòu)建復(fù)合涂層，不僅可以實現(xiàn)藥物的緩慢和局部釋放，還可以提高其生物利用度。體外釋藥研究表明該復(fù)合納米涂層的釋藥特征表現(xiàn)為少量的初期突釋以及隨后30 d的藥物緩慢釋放。研究表明吸附在微球表面或接近表面的藥物迅速溶解至釋放介質(zhì)中是造成藥物突釋的主要原因[13]。隨著PLLA的不斷降解，微球中包裹著的CTGF也隨之釋放從而形成了藥物的緩慢釋放。從復(fù)合納米微球涂層的降解電鏡照片可見，涂層的降解表現(xiàn)為兩方面：隨著時間的推移微球自身的變形降解以及微球表層降解后逐步從微孔中脫落，降解30 d后微孔中只剩下少量變形了的微球。

綜上所述，本研究在純鈦表面構(gòu)建出了具有緩慢釋放CTGF的復(fù)合納米微球涂層，載藥微球良好分布并固定在微弧氧化涂層的微孔中，該涂層是一種潛在的應(yīng)用于牙科種植體基臺表面的促進軟組織封閉的涂層，具有良好的應(yīng)用前景。