紅藻提取物對體外瘤胃發酵特性、產甲烷和微生物生長的影響

郭善軍

（達州職業技術學院，四川達州 635000）

在過去10年里，人為溫室氣體排放量迅速上升，值得注意的是，甲烷氣體的全球變暖潛力是二氧化碳的25倍，但自19世紀初以來，其濃度增加了兩倍。農業生產是甲烷排放的主要來源，特別是反芻動物養殖，其甲烷排放量占全球總量的25%（周艷等，2018）。因此，在不影響瘤胃功能的前提下，動物營養學家對減少甲烷排放非常感興趣。部分飼料添加劑在減少動物溫室氣體排放方面具有很大潛力，同時也可以改善飼料利用率，提高動物生產性能（Grainger和Beauchemin，2011）。潛在的飼料添加劑包括鹵化類似物、單寧素和一系列植物化合物，如精油、皂苷和各種次生代謝產物。藻類是一種很具前景的飼料添加劑，有各種各樣的形式，根據大小可分為微藻類與大藻類，根據主要色素可分為綠色、紅色或棕色，其中大藻類是代謝必需化合物的豐富來源，包括各種礦物質、維生素、蛋白質、脂類和多糖，因此，大藻類添加劑可以提高反芻動物飼料質量、生長速度、飼料轉化效率，降低反芻動物腸道甲烷排放（Bozic等，2009）。但很少有研究確定藻類飼料添加劑如何影響反芻動物瘤胃發酵特性和甲烷減排。因此，本研究旨在探討紅藻提取物對體外瘤胃發酵參數和甲烷排放的影響。

1 材料與方法

1.1 瘤胃體外發酵設計 選擇一只體重為（450±30）kg帶有瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛作為瘤胃液供體，試驗動物可以自由舔飼礦物質維生素鹽塊和飲水。每天在早上9點和下午5點用苜蓿草和濃縮料搭配（60∶40）的全混合日糧飼喂1次，飼喂量為奶牛體重的2%。早上飼喂前收集瘤胃液，四層紗布過濾后用人工唾液稀釋，保存在39℃。將15 mL的混合物厭氧分配到50 mL的血清瓶中，其中含有0.3 g苜蓿草底物和紅藻提取物。用鋁蓋丁基橡膠塞在純氮氣中厭氧密封，置于搖瓶箱中，體外發酵試驗采用完全隨機區組設計，一式三份，使用126個血清瓶（6次處理×7次孵育×3次重復）。

1.2 瘤胃發酵特征和微生物生長速度 使用可拆卸壓力傳感器和數字可讀電壓表，用氣相色譜法測定樣品中的總氣體產量，使用羧酸-1006 Plot毛細管柱TCD檢測器測量甲烷和二氧化碳含量。然后取無蓋血清瓶對培養基進行采樣，進行pH、氨氮和揮發性脂肪酸分析。用紫外/可見分光光度計在630 nm處測定。參考Denis等（2010）研究方法分析干物質體外瘤胃發酵降解率。發酵周期結束時以3000×rpm離心樣品3 min，去除飼料顆粒。上清以14000×rpm再次離心3 min，得到蛋白和葡萄糖分析的最終上清樣品。部分上清液采用考馬斯亮藍 G-250染色，在595 nm處分光光度法測定OD蛋白含量。測量取200 μ L上層清液加入600 μ L DNS、沸水孵育5 min，葡萄糖濃度為595 nm處的OD值。用磷酸鈉緩沖液（pH 6.5）將離心得到的顆粒再洗滌4次，然后在550 nm處進行OD測量，以評估微生物的生長速度。

1.3 統計分析 所有數據均采用SAS一般線性模型程序進行分析，各處理間均值差異采用Duncan's進行多重比較，數據以“平均值±標準誤差”表示，顯著性為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 瘤胃體外發酵特征 由表1可知，與對照組相比，紅藻提取物組提高了發酵6、9、12和72 h的pH（P＜0.05），處理1組顯著提高了6和12 h的pH（P＜0.05）。處理組較對照組顯著降低了瘤胃體外發酵3和6 h氣體產量（P＜0.05），但處理2組顯著提高了24和72 h的氣體產量（P＜0.05）。除了處理4組在72 h顯著降低了干物質損失率外（P＜0.05），對照組與其他處理組對干物質損失率無顯著影響（P＞0.05）。

由表2可知，紅藻提取物組較對照組顯著降低了瘤胃體外發酵12和24 h甲烷排放量（P＜0.05），但處理3組較對照組顯著提高了9 h二氧化碳排放量（P＜0.05）。紅藻提取物組較對照組顯著提高了9 h氨氮排放量（P＜0.05）。

表1 不同紅藻提取物對瘤胃微生物體外發酵的影響

表2 不同紅藻提取物對瘤胃發酵甲烷、二氧化碳和氮排放的影響

由表3可知，紅藻提取物組改善了12和24 h瘤胃發酵乙酸產量（P＜0.05）。瘤胃體外發酵12 h 后紅藻提取物組較對照組顯著提高了丙酸產量（P＜0.05），同時也顯著降低了乙酸和丙酸比值（P ＜ 0.05）。

表3 不同紅藻提取物對瘤胃乙酸和丙酸含量的影響

2.2 瘤胃微生物生長速度、蛋白質和葡萄糖濃度 由表4可知，與對照組相比，紅藻提取物組顯著降低了6 h瘤胃微生物的生長速度（P＜0.05），但處理1組顯著提高了24 h瘤胃微生物生長速度（P＜0.05）。此外，除了處理2和3組外，其他處理組較對照組均顯著提高了瘤胃發酵9 h的蛋白質濃度（P＜0.05）。處理3組在瘤胃發酵3 h時降低了葡萄糖濃度（P＜0.05），但處理1和2組在24 h、處理3組在48 h均顯著提高了葡萄糖濃度（P＜ 0.05）。

表4 不同紅藻提取物對瘤胃微生物生長速度、蛋白質和葡萄糖濃度的影響

3 討論

總的來說，在紅藻提取物處理組中，pH始終保持在6.12～7.47之間。有趣的是，對照組發酵后pH最低，這表明添加紅藻提取物在微生物發酵過程中創造更堿性的環境。由于瘤胃微生物活性的理想pH在5.0～7.8之間，所以海藻提取物可能有負面影響（Ha等，2005）。紅藻提取物增加了總氣體產量，而干物質降解率沒有任何差異。此外，所有紅藻提取物處理組的總產氣量僅在24和72 h孵育時顯著高于對照組，這暗示了一種提高飼料效率的策略。雖然利用陸生植物來調控腸道甲烷排放已被廣泛研究，但本研究證明了紅藻提取物可以有效降低體外甲烷排放，改變瘤胃微生物多樣性，這與Dubois等（2013）的研究結果一致。

紅藻提取物顯著降低了6 h微生物生長速率，但在24 h孵育后增加，這種模式可能是因為瘤胃微生物在第6小時適應了不斷變化的環境條件，并在24 h成指數生長。48 h后養分枯竭，可能會抑制微生物生長。此外，我們還觀察到，微生物生長速率越高的紅藻提取物處理組總產氣量越高，pH越低，這一結果與Ha等（2005）的研究一致，即瘤胃微生物生長速率與總產氣量和發酵密切相關。盡管瘤胃氨濃度隨飼料蛋白質比例和降解速率變化而變化，使用苜蓿草為唯一底物導致氨濃度沒有顯著差異（除了6 h）。維持瘤胃微生物增長的最適氨濃度為8 mg/dL，而當氨濃度≥140 mg/dL時會抑制微生物生長（Ha等，2005），同時，維持最佳氨濃度可以提高大多數瘤胃微生物的蛋白質合成，但這兩個變量不相關。總的來說，觀察到的氨濃度為1.90～30.80 mg/dL時是瘤胃正常發酵的一個強有力的指標，沒有顯示出紅藻提取物具有負面影響。反芻動物瘤胃微生物發酵釋放的揮發性脂肪酸是主要終產物，而不是葡萄糖。本研究發現，丙酸在12和24 h瘤胃發酵后顯著增加，葡萄糖濃度在24和48 h相應增加，這一結果與丙酸是最豐富的葡萄糖生成基質（Larsen 和 Kristensen，2009）。

4 結論

紅藻提取物是一種可行的飼料添加劑，可以提高反芻動物的瘤胃發酵產氣量，降低乙酸和丙酸比值，減少甲烷排放。但還需進一步評估紅藻提取物對反芻動物采食量、飼料利用效率和甲烷減排的影響及其機理。