中草藥提取物與抗菌藥聯用對耐藥大腸桿菌的抑菌作用研究

郝 督，陳 琛，張小鶯*

（1.新疆農業大學動物醫學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中 723000）

從醫學角度來看，大腸桿菌（E.coli）主要是一種存在于肝腸菌內的科埃希菌，從菌群性質上來看，屬于革蘭氏陰性無芽孢直桿菌，全身密布鞭毛，具有可活動性，無明顯的芽孢（張炳亮等，2018）。大腸桿菌主要危害豬、牛、羊、雞、鴨、鵝、兔等多種幼畜（禽）。從傳染途徑來看，消化道及呼吸道等都是大腸桿菌的直接傳染途徑，幼畜或者幼禽一旦發生感染往往具有急性特點，且有較高的致死率，常見的大腸桿菌病主要包括豬黃、白痢、雛雞大腸桿菌等。

隨著畜牧業快速發展，大腸桿菌病癥日益凸顯，抗菌藥物發揮了無可替代的作用（高海濤等，2017）。但如果無節制的使用過量抗菌藥物容易激發或擴散動物源設耐藥病原菌，并引起藥物殘留和耐藥性增加等附加問題，在人和動物間引起嚴重的耐藥現象，嚴重阻礙臨床治療活動的開展。因此，尋找對大腸桿菌作用效果明顯的中草藥，研制出廉價高效的抗菌新藥物對防治該病具有重要意義。

隨著現代藥理學的發展，在相關理論和技術支持下，大量植物源抑菌、抗菌化學成分和殺菌化等一系列具有較大開發潛力的化學成分被發現（紀曉宇等，2015；李仲興等，2004），經過反復研究與實踐發現，部分中草藥聯合其他抗菌藥不但可以全面提升抗菌藥自身抗菌活性，而且能在一定程度上有效限制耐藥菌的生長（劉云寧等，2015）。

從傳統中草藥中提取天然化合物，拓展其應用范圍，尋求替代抗菌藥物對抗多重耐藥菌已成為全球關注的熱點問題（植嬋萍等，2015），具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 黃連、夏枯草、茵陳、大青葉、甘草、山楂、女貞子、蒲公英、五倍子、艾葉采購于楊凌同康醫藥超市。硫酸慶大霉素粉末、硫酸大觀霉素粉末；硫酸慶大霉素注射液；硫酸阿米卡星注射液；硫酸卡那霉素注射液，酵母提取物；胰蛋白胨；瓊脂粉。

1.1.2 試驗菌株 試驗所采用的菌株主要是由西北農林科技大學相關實驗室提供的標準大腸桿菌和耐藥大腸桿菌。

1.1.3 實驗儀器 RE-52AA型旋轉蒸發儀；超聲波清洗儀；SW-CJ-1D型超凈工作臺；電熱恒溫鼓風干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 中草藥制劑的制備 以研磨器材粉碎所有藥材，每種藥材各取50 g，以高于藥材10倍左右的蒸餾水進行為期24 h的浸泡，并采取超聲技術對其進行破碎。經過靜置沉淀后，將其中殘渣進行過濾篩除，將藥液以旋轉蒸發儀進行濃縮，將其濃度控在1 g/mL，3000 r離心15 min，提取產生的清液，4℃儲存。

1.2.2 抗菌藥溶液的制備 大觀霉素和慶大霉素粉末各40.96 mg，添加10 mL的蒸餾水進行溶解，使其溶液達到4096 μ g/mL，儲存溫度以4℃為最佳。將慶大霉素注射液、阿米卡星注射液、卡那霉素注射液濃度調至4096 μ g/mL，制備成儲備液，4℃儲存備用。

1.2.3 菌懸液的制備 以LB液體作為培養基，接種菌株，在溫度恒定（37℃）的振蕩培養箱有效培養，利用滅菌生理鹽水調整菌液濁度，得到1.5×107～ 1.5×108CFU/mL的菌懸液（董自艷等，2014），備用。

1.2.4 中草藥提取物的抑菌圈測定 采用牛津杯法（葉文初等，2016）測定中草藥提取物的抑菌圈，主要判斷依據分為低度敏感、中度敏感、高度敏感及極度敏感，具體標準如下：

低度敏感——抑菌圈直徑＜10 mm；

中度敏感——抑菌圈直徑在10～14 mm；

高度敏感——抑菌圈直徑在15～19 mm；

極度敏感——抑菌圈直徑≥20 mm。

1.2.5 試管兩倍稀釋法測定中草藥、抗菌藥對耐藥大腸桿菌的最小抑菌濃度 依據臨床和實驗室標準協會相關標準，在測定中草藥提取物或抗菌藥單獨抑菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度時可采用試管二倍稀釋法（潘婕等，2015）。

1.2.6 中草藥與抗菌藥聯用對耐藥大腸桿菌微量抑制濃度指數測定 有效運用微量肉湯棋盤稀釋法，在確保環境無菌性的情況下，按照96孔細胞培養板X軸、Y軸順序依次稀釋系列濃度的寒窯液體培養基（宋劍武，2014）。

表1 十種中草藥提取物對大腸桿菌抑菌圈測定

2 結果與分析

2.1 抑菌試驗測定結果 由表1可知，采用牛津杯法測定8種中草藥煎液對大腸桿菌的敏感性，其中山楂、五倍子女貞子、夏枯草提取物對大腸桿菌的抑菌作用最強，為高度敏感，抑菌圈分別為20.4、22.8、15.1和 17.1 mm ；黃連、大青葉提取物對大腸桿菌的藥物敏感性均表現為中度敏感；其余4種中草藥提取物對大腸桿菌的抑菌作用均表現為低度敏感。

2.2 中草藥提取物MIC測定結果 由表2可知，在大腸桿菌抑菌過程中，不同中草藥提取物所產生的抑菌效果不盡相同，其中效果最為明顯的是五倍子相關提取物。最低抑菌濃度值為31.25 mg/mL；抑菌效果最差的數茵陳，最低抑菌濃度值僅為125 mg/mL。

2.3 抗菌藥MIC測定結果 由表3可知，氨基糖苷類不同抗菌藥對大腸桿菌的抑菌效果不同，各抗菌藥的MIC值存在一定差異，所選的4種抗菌藥中，硫酸慶大霉素對大腸桿菌MIC值為8 μ g/mL，硫酸阿米卡星、硫酸卡那霉素的MIC值均為16 μ g/mL，而鹽酸大觀霉素比其他3種氨基糖苷類抗菌藥對大腸桿菌有較弱的抑菌作用，MIC值高于 32 μ g/mL。

2.4 聯合抑菌實驗結果 由表4可知，中草藥與抗菌藥聯合作用時，除山楂與硫酸大觀霉素、五倍子與硫酸慶大霉素、女貞子與硫酸卡那霉素聯合表現為協同作用外，大部分中草藥與抗菌藥組合表現為相加作用，少數組合出現拮抗作用和無關作用。

表2 十種中草藥提取物對大腸桿菌MIC值測定

表3 抗菌藥對大腸桿菌MIC值測定

表4 中草藥聯合抗菌藥對大腸桿菌的體外聯合抑菌結果

3 討論

目前防治大腸桿菌病主要應用抗菌藥，但抗菌藥的過量使用會破壞腸道先天免疫力，引起菌群失調癥，形成耐藥菌株，從而加大防治難度。中草藥作為中醫、中獸醫的重要一環，抗菌作用有著悠久的歷史。根據近期相關研究資料顯示，部分中草藥確實具有抗菌、細菌耐藥性延緩和消除等作用，不同于傳統抗菌藥，中草藥內富含多種藥效成分，其作用為多靶點形式，無較為顯著的毒性特征，產生耐藥性的可能性相對較低。中草藥提取物不但能預防和抵抗大腸桿菌，且能有效促進動物生長，強化機體免疫力，有效抵抗各種疾病。周志遠（2013）研究發現，聯合應用黃芩、黃連、恩若沙星等能有效提升抑菌活性，且能在某種程度上實現對大腸桿菌耐藥性的有效抑制。