UPLC-PDA法測(cè)定甘草浸膏中甘草苷和甘草酸的含量

魏秀麗，張傳津*，馮言言，崔 進(jìn)，李有志，徐恩民

(1.山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所,山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)與精準(zhǔn)化用藥山東省工程實(shí)驗(yàn)室,山東省動(dòng)物用中藥制劑工程實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250022；2.齊魯動(dòng)物保健品有限公司，濟(jì)南 250100)

甘草浸膏活性成分主要包括甘草苷、甘草酸，在人醫(yī)臨床用于治療支氣管哮喘、咽炎、支氣管炎等；在獸醫(yī)臨床也用于緩解改善動(dòng)物呼吸道疾病的癥狀，主要功效為祛痰止咳，也是制作甘草顆粒、甘草流浸膏等的原料。在中國(guó)藥典和獸藥典等文獻(xiàn)中甘草浸膏或其他甘草制劑對(duì)甘草苷、甘草酸的含量測(cè)定均采用普通高效液相色譜方法[1-7]，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)研究了超高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法(UPLC-PDA)測(cè)定甘草浸膏中甘草苷和甘草酸的含量，簡(jiǎn)單快速，經(jīng)濟(jì)環(huán)保。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 甘草酸銨對(duì)照品，批號(hào)11073-2017020，含量97.7%，中國(guó)食品藥品檢定研究院。甘草苷對(duì)照品，批號(hào)111610-201005，含量94.9%，中國(guó)藥品生物制品檢定所。乙腈、冰醋酸、醋酸銨均為色譜純；乙醇分析純；超純水。甘草浸膏，來(lái)自獸藥生產(chǎn)企業(yè)報(bào)批產(chǎn)品。

1.2 儀器 Waters AcquityTMUltra performance LC超高效液相色譜儀，美國(guó)Waters 公司；Waters2695高效液相色譜儀，美國(guó)Waters 公司。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液制備 精密稱取本品研細(xì)后的粉末，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備 精密稱取甘草苷對(duì)照品0.02012 g，置50 mL量瓶中，加70%乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密稱取甘草酸銨對(duì)照品(折合甘草酸為0.01959 g)，置100 mL量瓶中，加70%乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備 取兩種儲(chǔ)備液適量，配置成混合對(duì)照品溶液：每1 mL含甘草苷200 μg、甘草酸20 μg的溶液。依次倍比稀釋得一系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：10 μg/mL甘草苷100 μg/mL甘草酸、5 μg/mL甘草苷50 μg/mL甘草酸、2 μg/mL甘草苷20 μg/mL甘草酸、1 μg/mL甘草苷10 μg/mL甘草酸、0.5 μg/mL甘草苷5 μg/mL甘草酸、0.2 μg/mL甘草苷2 μg/mL甘草酸。

1.3.4 色譜操作條件及參數(shù) 色譜柱：T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%冰乙酸+5 mmol/L醋酸銨為流動(dòng)相B，按表1規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；二極管陣列檢測(cè)器，掃描范圍190～400 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)232 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣室溫度10 ℃，流速為0.35 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。

1.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)和精密度試驗(yàn) 精密吸取甘草苷對(duì)照品溶液和甘草酸對(duì)照品溶液，制成每1 mL含甘草苷10 μg、甘草酸100 μg的混合對(duì)照品溶液，重復(fù)配置6份，進(jìn)樣，計(jì)算甘草苷、甘草酸峰面積RSD。

精密吸取甘草苷對(duì)照品溶液和甘草酸對(duì)照品溶液，制成每1 mL含甘草苷10 μg、甘草酸100 μg的混合對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算甘草苷、甘草酸峰面積RSD。

表1 梯度洗脫條件表Tab 1 Gradient elution condition

1.3.6 檢測(cè)限和定量限的測(cè)定 對(duì)甘草苷、甘草酸的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行UPLC分析，并逐級(jí)降低其濃度，以溶液檢測(cè)時(shí)的信噪比(S/N)分別大于等于3和10 作為藥物的檢測(cè)限和定量限。

1.3.7 不同色譜條件樣品檢測(cè)比較 使用高效液相色譜儀(參照中華人民共和國(guó)獸藥典2015年版甘草浸膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)色譜條件[1], 流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL)和超高效液相色譜儀在不同的色譜條件下運(yùn)行，對(duì)同一樣品中兩主成分甘草苷、甘草酸的含量和出峰時(shí)間分別進(jìn)行比較。

1.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 進(jìn)樣室溫度設(shè)置到10 ℃。取1.3.5項(xiàng)下10 μg/mL甘草苷100 μg/mL甘草酸溶液，在10 ℃放置3、6、12、24 h，各進(jìn)樣1 μL，計(jì)算甘草苷、甘草酸各自的峰面積RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離 在優(yōu)化的色譜條件下，測(cè)得甘草苷、甘草酸色譜峰峰形良好，且均達(dá)到基線分離，在1.3.4項(xiàng)條件下，甘草苷、甘草酸對(duì)照品和甘草浸膏樣品待測(cè)液色譜保留時(shí)間為3.17、8.95 min左右，分離度均滿足要求。

2.2 線性 在選定的色譜條件下，使用梯度洗脫的方法，可以有效地分離目的峰，甘草酸在10～200 μg/mL范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1167.9x+1986.4，R2>0.999；甘草苷在 1～20 μg/mL范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=7348.3x+1104.8，R2=0.999。

理論塔板數(shù)：甘草酸、甘草苷均大于20000，分離度大于4.9，對(duì)稱因子1.1。校正曲線見(jiàn)圖1-圖2。

圖1 甘草苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1 Standard curve of liquiritin

圖2 甘草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 2 Standard curve of glycyrrhizic acid

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)和精密度試驗(yàn) 配制10 μg/mL甘草苷100 μg/mL甘草酸對(duì)照品溶液，重復(fù)配置6份，進(jìn)樣，計(jì)算甘草苷、甘草酸峰面積RSD分別為0.53%、0.48%，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

取10 μg/mL甘草苷100 μg/mL甘草酸對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算甘草苷、甘草酸峰面積RSD分別為0.41%、0.39%，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.4 檢測(cè)限和定量限 0.5 μg/mL甘草苷5 μg/mL甘草酸對(duì)照品溶液信噪比大于3為檢出限，1 μg/mL甘草苷10 μg/mL甘草酸對(duì)照品溶液信噪比大于10為定量限。

2.5 不同色譜條件樣品檢測(cè)結(jié)果比較 不同波長(zhǎng)下的主成分響應(yīng)值的比較見(jiàn)表2。通過(guò)響應(yīng)值比較及光譜圖各成分的最大吸收波長(zhǎng)，并顧及兩種成分的峰面積平衡，選擇232 nm。色譜圖見(jiàn)圖3-圖13。

表2 不同波長(zhǎng)下的主成分相應(yīng)情況Tab 2 Principal component response at different wavelengths

圖3 對(duì)照品20μg/mL甘草苷200μg/mL甘草酸UPLC色譜圖(252 nm)Fig 3 UPLC chromatogram of reference solution of 20μg/mL Liquiritin and 200μg/mL glycyrrhizic acid

圖4 對(duì)照品20μg/mL甘草苷200 μg/mL甘草酸UPLC色譜圖(232 nm)Fig 4 UPLC chromatogram of reference solution of 20 μg/mL Liquiritin and 200 μg/mL glycyrrhizic acid

圖5 對(duì)照品 20μg/mL甘草苷200μg/mL甘草酸UPLC色譜圖(237 nm)Fig 5 UPLC chromatogram of reference solution of 20μg/mL Liquiritin and 200μg/mL glycyrrhizic acid

圖6 對(duì)照品 20 μg/mL甘草苷200 μg/mL甘草酸HPLC色譜圖(237 nm)Fig 6 UPLC chromatogram of reference solution of 20μg/mL Liquiritin and 200μg/mL glycyrrhizic acid

圖7 樣品1 UPLC色譜圖(252 nm)Fig 7 UPLC chromatogram of sample 1

圖8 樣品1 UPLC色譜圖(232 nm)Fig 8 UPLC chromatogram of sample 1

圖9 樣品1 UPLC色譜圖(237 nm)Fig 9 UPLC chromatogram of sample 1

圖10 樣品1 HPLC色譜圖(237 nm)Fig 10 HPLC chromatogram of sample 1

圖11 樣品2 UPLC色譜圖(232 nm)Fig 11 UPLC chromatogram of sample 2

圖12 樣品2色譜圖UPLC(237 nm)Fig 12 UPLC chromatogram of sample 2

圖13 樣品2色譜圖UPLC(252 nm)Fig 13 UPLC chromatogram of sample 2

使用Waters超高效液相色譜儀(本實(shí)驗(yàn)色譜條件見(jiàn)1.3.4)和高效液相色譜儀(見(jiàn)1.3.7)，對(duì)同一樣品中按濕品計(jì)算兩主成分甘草苷、甘草酸的含量分別進(jìn)行了比較，無(wú)顯著差異，相對(duì)偏差均小于1%，表明本實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單可行，結(jié)果精確可靠。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同色譜條件檢測(cè)結(jié)果 (n=4)Tab 3 Test results using different chromatographic method (n=4)

由于兩種色譜方法均已通過(guò)其方法學(xué)驗(yàn)證，均可以準(zhǔn)確控制其指標(biāo)成分。從檢測(cè)效率上看，優(yōu)選超高效法(UPLC)，各色譜圖見(jiàn)圖3-圖10。從樣品噪音和峰形分離度等方面來(lái)看，優(yōu)選超高效液相色譜儀條件，背景更干凈，與雜質(zhì)峰的分離度更好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照實(shí)驗(yàn)方法，將對(duì)照品溶液貯存一段時(shí)間后進(jìn)樣，所得到的圖譜中甘草苷、甘草酸峰面積RSD分別為0.38%、0.46%，說(shuō)明樣品穩(wěn)定，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本研究將甘草苷、甘草酸的對(duì)照溶液利用PDA檢測(cè)器采集其光譜圖，在波長(zhǎng)190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)甘草苷在232 nm處有最大吸收，甘草酸在252 nm處有最大吸收，根據(jù)光譜圖可以判斷含有主成分,能替代藥典中2項(xiàng)鑒別：顏色反應(yīng)和薄層鑒別，而且快速，不需要繁雜的處理過(guò)程，減少了硫酸、正丁醇、乙酸乙酯等多種提取溶劑和薄層展開(kāi)溶劑，可以節(jié)約數(shù)小時(shí)提取、展開(kāi)、噴霧等所需要的工作量。

參考獸藥典含量測(cè)定項(xiàng)中選用的波長(zhǎng)237 nm，在本實(shí)驗(yàn)中選擇232、237、252 nm分別采集色譜圖考察其峰面積響應(yīng)、對(duì)稱因子以及分離度等，由于甘草苷的響應(yīng)值較低，最終選擇232 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。光譜圖見(jiàn)圖14-圖15。兩者保留時(shí)間分別為3.2、8.9 min。

3.2 流動(dòng)相流速的比較 超高效液相流動(dòng)相的流速為0.35 mL/min，需要運(yùn)行11 min，每針運(yùn)行需要3.85 mL流動(dòng)相；高效液相色譜儀器流速為1.0 mL/min，運(yùn)行時(shí)間50 min，每針運(yùn)行需要50 mL流動(dòng)相。超高效液相色譜更節(jié)約實(shí)驗(yàn)耗材溶劑等，每運(yùn)行一針流動(dòng)相節(jié)省46.15 mL。在廢液處理高成本的今天，超高效液相色譜方法更有優(yōu)勢(shì)，更經(jīng)濟(jì)快捷。

3.3 本方法與藥典方法的結(jié)果對(duì)比 本實(shí)驗(yàn)選擇了兩個(gè)企業(yè)的甘草浸膏進(jìn)行含量測(cè)定，分別采用高效液相色譜方法和超高效液相色譜方法，甘草浸膏甘草苷和甘草酸含量相對(duì)偏差均小于1%，本方法運(yùn)行一針需要11 min，比藥典方法50 min節(jié)約了39 min的時(shí)間，大大提高檢測(cè)效率。

本實(shí)驗(yàn)建立了超高效液相色譜法對(duì)甘草浸膏中甘草苷和甘草酸進(jìn)行定性和定量測(cè)定，具備精準(zhǔn)快捷、經(jīng)濟(jì)環(huán)保的特點(diǎn)，可以作為企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)方法，有效控制甘草浸膏質(zhì)量。

圖14 甘草苷對(duì)照溶液光譜圖Fig 14 Control solution spectrum of liquiritin

圖15 甘草酸對(duì)照溶液光譜圖Fig 15 Control solution spectrum of glycyrrhizic acid