PD98059聯合紫杉醇對人胃印戒細胞癌細胞增殖和凋亡的影響

賽福丁·柯尤木 布力布·吉力斯漢 馬蘭英 李娜 阿布拉江·塔依爾 劉翠云 舍玲 唐勇

摘 要 目的：探討絲裂原激活蛋白激酶激酶/細胞外信號調節激酶（MEK/ERK）通路特異性抑制劑PD98059聯合紫杉醇對人胃印戒細胞癌細胞增殖和凋亡的影響。方法：以人胃印戒細胞癌KATOⅢ細胞為對象，采用CCK-8法檢測紫杉醇、PD98059以及兩藥聯合作用48 h后的細胞增殖情況，并計算增殖抑制率;采用流式細胞術、Western blotting、Transwell法分別檢測紫杉醇、PD98059以及兩藥聯合作用48 h或24 h后的細胞凋亡、凋亡相關蛋白[分裂型胱天蛋白酶3（Cleaved-caspase-3）]表達和細胞遷移情況。結果：經紫杉醇（1 μg/mL）、PD98059（5、20、40 μmol/L）以及兩藥（1 μg/mL+5、20、40 μmol/L）聯合作用后，各給藥組細胞的增殖抑制率均顯著升高，且聯用組顯著高于紫杉醇、PD98059同劑量單用組（P<0.05）。經紫杉醇（1 μg/mL）、PD98059（40 μmol/L）以及兩藥（1 μg/mL+40 μmol/L）聯合作用后，紫杉醇組和兩藥聯用組細胞的早期、晚期凋亡率以及Cleave-caspased-3蛋白的表達量均顯著升高，且聯用組顯著高于紫杉醇、PD98059單用組（P<0.05）;各給藥組的細胞遷移數均顯著減少，且聯用組顯著少于紫杉醇、PD98059單用組（P<0.05）。結論：紫杉醇、PD98059均可抑制人胃印戒細胞癌KATO Ⅲ細胞的增殖和遷移，且紫杉醇還可促進該細胞的凋亡及凋亡相關蛋白的表達，上述作用可能與抑制MEK/ERK通路有關。兩藥聯用的效果優于紫杉醇或PD98059單用。

關鍵詞 人胃印戒細胞癌;紫杉醇;PD98059;增殖;凋亡;凋亡相關蛋白;遷移;絲裂原激活蛋白激酶激酶/細胞外信號調節激酶通路;KATO Ⅲ細胞

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects of MEK/ERK pathway specific inhibitor PD98059 combined with paclitaxel on the proliferation and apoptosis of human gastric signet ring cell carcinoma （SRCC） cells. METHODS： Using human SRCC KATO Ⅲ cells as object， CCK-8 assay was used to detect cell proliferation after treated with paclitaxel， PD98059 and two drug combination for 48 h， and the proliferation rate was calculated. Flow cytometry， Western blotting and Transwell assay were used to detect the cell proliferation， the expression of apoptosis related protein （Cleaved-caspase-3） and cell migration after treated with paclitaxel， PD98059 and two drug combination for 48 or 24 h. RESULTS： After treated with paclitaxel （1 μg/mL）， PD98059 （5， 20， 40 μmol/L） and two drug combination （1 μg/mL+5， 20， 40 μmol/L）， the proliferation rate of cells was increased significantly in administration groups， and the combination groups were significantly higher than paclitaxel and PD98059 alone groups （P<0.05）. After treated with paclitaxel （1 μg/mL）， PD98059 （5， 20， 40 μmol/L） and two drug combination （1 μg/mL+40 μmol/L）， early and late apoptosis rate， the protein expression of Cleaved-caspase-3 were significantly increased in paclitaxel group and combination group; combination group was significantly higher than paclitaxel and PD98059 alone group （P<0.05）. The number of migrated cells in administration groups were reduced significantly， and the combination group was significantly lower than paclitaxel and PD98059 alone group （P<0.05）. CONCLUSIONS： Paclitaxel and PD98059 can inhibit the proliferation and migration of human SRCC KATO Ⅲ cells， paclitaxel can also promote the apoptosis and the expression of apoptosis related protein， which may be related to the inhibition of MEK/ERK pathway. The effect of the combination of the two drugs is better than paclitaxel or PD98059 alone.

KEYWORDS? ?Human grastric signet ring cell carcinoma; Paclitaxel; PD98059; Proliferation; Apoptosis; Apoptosis related protein; Migration;MEK/ERK pathway; KATO Ⅲ cells

胃印戒細胞癌是基于微觀組織形態學分型的一種特殊病理類型的胃癌，其鏡檢可見腫瘤細胞胞質豐富、充滿黏液，細胞核被擠壓于胞質一側呈“印戒”樣[1-2]。近年來，隨著幽門螺旋桿菌根治術的應用，胃癌的發病率雖有所下降，但胃印戒細胞癌的發病率卻有所上升，占胃癌總發病率的8%～30%[1-3];同時有報道指出，與非印戒細胞癌相比，胃印戒細胞癌多發于年輕女性[4]。目前，胃印戒細胞癌的臨床治療主要以手術及化療為主，但胃印戒細胞癌患者對化療藥物不敏感，且腫瘤細胞一旦突破黏膜下層，則極易發生轉移，導致患者預后不佳[5]。PD98059是一種絲裂原激活蛋白激酶激酶/細胞外信號調節激酶（MEK/ERK）通路的特異性抑制劑，能有效阻止MEK對ERK的磷酸化，阻滯細胞內相關通路信號的轉導，從而影響腫瘤細胞增殖、分化、凋亡等一系列生物反應[6]。紫杉醇作為一種天然植物來源的抗癌藥物，廣泛應用于包括胃癌在內的多種腫瘤的臨床治療，其單藥有效率達20%～40%，但隨著作用時間的延長，靶癌細胞產生的分子學抵抗限制了該藥抗癌作用的發揮[7-8]。有研究指出，PD98059與紫杉醇等其他抗腫瘤藥物聯用可增強后者的抗癌效果[9];且本課題組前期研究也有類似發現。基于此，本研究擬通過分析PD98059聯合紫杉醇對人胃印戒細胞癌細胞增殖和凋亡的影響，初步探討聯合用藥的抗癌效果，旨在為胃印戒細胞癌的治療提供新的靶點和思路。

1 材料

1.1 儀器

FORM 361型細胞培養箱、MK2型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）;Accuri C6型流式細胞儀（美國BD公司）;Mini-Protean型蛋白電泳系統（美國Bio-Rad公司）;5200型全自動化學發光圖像分析系統（上海天能科技有限公司）;Ti-E型顯微鏡（日本Nikon公司）;5702型常溫離心機（德國Eppendrof公司）。

1.2 藥品與試劑

紫杉醇對照品（北京索萊寶科技有限公司，批號：IP0020，純度：>98%）;PD98059對照品（美國MCE公司，批號：12764，純度：99.33%）;IMDM培養基、胎牛血清、胰酶（美國Gibco公司，批號分別為8228124、41G3332K、1730153）;Transwell測試盒（美國Corning公司，批號：27113030）;CCK-8試劑盒、含磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白上樣緩沖液、聚丙烯酰胺凝膠配膠試劑盒、結晶紫染色試劑（上海碧云天生物科技有限公司，批號分別為C0038、P0013B、P0010、P0015L、P0012AC、C0121）;膜聯蛋白Ⅴ-硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）凋亡檢測試劑盒（美國Invitrogen公司，批號：1753025）;山羊抗兔分裂型胱天蛋白酶3（Cleaved-caspase-3）抗體、山羊抗兔甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG二抗（美國CST公司，批號分別為12/2017、10/2017、06/2017）;ECL發光試劑盒（美國Millipore公司，批號：1722003）;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細胞

人胃印戒細胞癌細胞株KATO Ⅲ由中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫提供。

2 方法

2.1 細胞培養

將胃印戒細胞癌KATO Ⅲ細胞解凍、復蘇并接種至含有10%胎牛血清的IMDM培養基（以下簡稱“完全培養基”）中，于5%CO2、37 ℃條件（下同）下培養，約3 d傳代1次，取對數生長期的細胞進行后續試驗。

2.2 細胞增殖情況

采用CCK-8法檢測。取對數生長期的KATO Ⅲ細胞，經胰酶消化后，將其用完全培養基調整至5×104個/mL，按100 μL/孔接種至96孔板中，培養24 h，將細胞隨機分為對照組，紫杉醇組（1 μg/mL），PD98059低、中、高劑量組（5、20、40 μmol/L）以及紫杉醇+PD98059聯用組（1 μg/mL紫杉醇分別與5、20、40 μmol/L PD98059聯用），各給藥組劑量參考本課題組前期預試驗結果設置，每組設3個復孔。對照組加入完全培養基100 μL，各給藥組加入含相應藥物的完全培養基100 μL，繼續培養48 h。棄去培養基，每孔加入CCK-8試劑10 μL，培養1 h后，使用酶標儀于450 nm波長處檢測各孔光密度（OD）值，并計算細胞增殖抑制率：增殖抑制率=[（對照組細胞平均OD值-試驗組細胞平均OD值）/對照組細胞平均OD值]×100%。上述試驗重復3次（下同）。

2.3 細胞凋亡情況

采用流式細胞術檢測。取對數生長期的KATO Ⅲ細胞，經胰酶消化后，將其用完全培養基調整至5×106個/mL，按100 μL/孔接種至6孔板中，培養24 h，將細胞隨機分為對照組、紫杉醇組（1 μg/mL）、PD98059組（40 μmol/L）和紫杉醇+PD98059聯用組（1 μg/mL+40? ? ?μmol/L），各給藥組劑量參考“2.2”項下結果設置，每組設3個復孔。對照組加入完全培養基2 mL，各給藥組加入含相應藥物的完全培養基2 mL，繼續培養48 h。收集細胞，以800 r/min離心5 min，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）清洗3次。隨后用PBS調整細胞密度至1×106個/mL，取上述細胞懸液1 L，以800 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀加入Annexin Ⅴ-FITC結合液195 μL，輕輕重懸，然后依次加入Annexin Ⅴ-FITC染色液5 μL和PI染色液10 μL，輕輕混勻，于冰浴中染色20 min后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，并使用Excel 2007軟件計算各組細胞的早期、晚期凋亡率。

CCK-8試驗結果顯示，各給藥組細胞的增殖抑制率均較對照組顯著升高，且兩藥聯用組的抑制率顯著高于紫杉醇、PD98059同劑量單用組;同時，20 μmol/L PD98059的抑制作用與1 μg/mL紫杉醇相當，且抑制率有隨PD98059劑量增加而升高的趨勢。由此可見，兩藥聯用對細胞增殖的抑制作用明顯優于紫杉醇、PD98059單獨使用，這可能與PD98059對細胞增殖的抑制主要是作用于G1期，將細胞周期阻滯在G0/G1期[17]，而紫杉醇則主要是將細胞周期阻滯在G2/M期[10-11]有關。

有研究指出，減少細胞凋亡信號通路中ERK的磷酸化能有效抑制胱天蛋白酶9（Caspase-9）的表達，從而發揮減少細胞凋亡的作用，因此抑制MEK/ERK通路常作為誘導腫瘤凋亡的靶點[18]。Caspase-9作為凋亡通路的啟動者，在收到上游信號后，可通過自剪接而激活，隨后引發Caspase的級聯反應。Caspase-3作為Caspase-9的響應分子之一，在被Caspase-9激活后，其可通過剪切產生活性Cleaved-caspase-3，后者可直接降解細胞內的結構蛋白和功能蛋白，從而誘導細胞凋亡[18-19]。本研究通過流式細胞術和Western blotting法分別檢測了KATO Ⅲ細胞的凋亡情況和凋亡蛋白Cleaved-caspase-3的表達水平。結果顯示，與對照組比較，紫杉醇組和紫杉醇+PD98059聯用組細胞的早期、晚期凋亡率和Cleaved-caspase-3的相對表達量均顯著升高，且聯用組顯著高于紫杉醇、PD98059單用組;而雖PD98059有增加細胞凋亡和凋亡蛋白表達的趨勢，但組間比較差異均無統計學意義。這提示PD98059單獨使用時，對胃印戒細胞癌細胞的促凋亡作用并不明顯;而當該藥與紫杉醇聯用時，則可明顯促進細胞的凋亡，提高相關凋亡蛋白的表達水平，并可同時增強紫杉醇對KATO Ⅲ細胞的促凋亡作用，其機制可能與PD98059通過抑制MEK/ERK通路從而增強細胞對紫杉醇的敏感性有關[20]。

本研究進一步通過Transwell法檢測了PD98059聯合紫杉醇對KATO Ⅲ細胞遷移能力的影響。結果顯示，各給藥組的遷移細胞數均較對照組顯著減少，且聯用組顯著少于紫杉醇、PD98059單用組。這提示兩種藥物均可抑制KATOⅢ細胞的遷移，其中紫杉醇可通過降低相關細胞機能、PD98059可通過抑制ERK磷酸化來減少基質金屬蛋白酶2等的表達，從而發揮遷移抑制作用[21]。與此同時，兩藥聯用的抑制作用強于任一藥物單用，筆者推測這可能與兩藥效果疊加有關。

綜上所述，紫杉醇和PD98059均可抑制人胃印戒細胞癌KATO Ⅲ細胞的增殖和遷移，且紫杉醇還可促進該細胞的凋亡及凋亡相關蛋白的表達，上述作用可能與抑制MEK/ERK通路有關;兩藥聯用的效果明顯優于紫杉醇或PD98059單用。本研究可為胃印戒細胞癌的臨床治療提供新策略，但PD98059協同紫杉醇對人胃印戒細胞癌細胞發揮抑制作用的分子機制仍未明確，且相關研究結論并未通過體內研究予以證實，故有待進一步探索。

參考文獻

[ 1 ] PERNOT S，VORON T，PERKINS G，et al. Signet-ring cell carcinoma of the stomach：impact on prognosis and specific therapeutic challenge[J]. World J Gastroenterol，2015，21（40）：11428-11438.

[ 2 ] 聶愛英，梁麗娟，雷超，等.胃印戒細胞癌臨床病理特點的分析[J].現代腫瘤醫學，2017，25（6）：914-917.

[ 3 ] AKABAH PS，MOCAN S，MOLNAR C，et al. Importance of optical diagnosis in early gastric cancer：a case report of early gastric signet ring cell carcinoma[J]. Niger J Clin Pract，2017，20（10）：1342-1345.

[ 4 ] 徐仲航，金殷植，房學東.胃印戒細胞癌的研究進展[J].中華胃腸外科雜志，2018，21（10）：1196-1200.

[ 5 ] 崔景利，梁寒，鄧靖宇，等.胃印戒細胞癌的臨床病理特點和預后分析[J].中華腫瘤雜志，2015，37（5）：367-370.

[ 6 ] LEE KC，TSAI JJ，TSENG CW，et al. Amentoflavone inhibits erk-modulated tumor progression in hepatocellular carcinoma in vitro[J]. In Vivo，2018，32（3）：549-554.

[ 7 ] 陳偉，季明華，唐金海.乳腺癌紫杉醇耐藥的機制[J/CD].中華乳腺病雜志：電子版，2015，9（4）：275-279.

[ 8 ] 田甜甜，李艷艷，沈琳，等.胃癌細胞中miR-135a表達對紫杉醇敏感性的影響[J].基礎醫學與臨床，2016，36（5）：672-677.

[ 9 ] LI Y，YANG Q. Effect of PD98059 on chemotherapy in patients with colorectal cancer through ERK1/2 pathway[J]. J BUON，2019，24（5）：1837-1844.

[10] JIANG X，ZHANG B，ZHOU Z，et al. Enhancement of radiotherapy efficacy by pleiotropic liposomes encapsulated paclitaxel and perfluorotributylamine[J]. Drug Deliv，2017，24（1）：1419-1428.