酢漿草的HPLC指紋圖譜建立及2種有效成分的含量測定

李小雙 李銀 劉文靜 王廣成 鄭林 陳思穎 李勇軍

摘 要 目的：建立酢漿草的高效液相（HPLC）指紋圖譜，并同時測定其中異牡荊素、當藥黃素的含量。方法：采用HPLC法。色譜柱為ACE Excel-5-C18，流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫），流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測波長為280 nm，進樣量為10 μL。以異牡荊素峰為參照，繪制12批酢漿草藥材樣品的HPLC指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》進行相似度評價，確定共有峰。按上述色譜條件同法測定異牡荊素、當藥黃素的含量。結果：12批酢漿草藥材樣品共有19個共有峰，相似度均大于0.89，同時指認異牡荊素、當藥黃素2個共有峰。異牡荊素、當藥黃素檢測質量濃度的線性范圍分別為3.91～117.36 μg/mL（r=0.999 4）、9.88～118.56 μg/mL（r=0.999 2）;定量限分別為0.675、3.587 μg/mL;檢測限分別為0.205、1.087 μg/mL;精密度、重復性、穩定性試驗的RSD均小于2%;加樣回收率分別為95.46%～99.10%（RSD=1.23%，n=6）、95.34%～101.23%（RSD=2.74%，n=6）;平均含量分別為0.227～1.654、0.641～2.052 mg/g。結論：所建指紋圖譜可用于酢漿草藥材的質量控制;含量測定方法簡便、準確，可用于同時測定其中2種成分的含量。

關鍵詞 酢漿草;高效液相色譜法;指紋圖譜;異牡荊素;當藥黃素;含量測定

酢漿草為酢漿草科植物酢漿草（Oxalis corniculata L.）的新鮮或干燥全草，又稱酸咪咪[1]，為貴州省少數民族常用藥材，具有清熱利濕、涼血消腫等功效[2]。該藥主要分布于我國華北、華中、華南及西南等地區[3]。有研究發現，酢漿草主要含有黃酮類、酚酸類等成分[4-7]，具有抗炎殺菌、活血化瘀、抗腫瘤、抗氧化、保肝等藥理活性[8-10]。本課題組前期的化學成分研究中，分離得到了其黃酮類的代表性成分異牡荊素、當藥黃素[11]。藥理活性研究表明，異牡荊素具有抗癌、抗炎、抗氧化等作用[9]，當藥黃素具有抗抑郁、抗炎等作用[12-13]。

指紋圖譜具有整體性、模糊性的特征，符合中醫藥傳統理論的特點，是中藥質量控制的有效手段;傳統單一化學成分的含量測定難以全面反映藥材質量，而多指標含量測定可在一定程度上更為有效地保證藥材質量，中藥材指紋圖譜結合多指標含量測定能全面地反映藥材質量優劣，已成為中藥質量控制的科學有效手段[14]。目前，酢漿草收錄于《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》[2]中，該標準僅對其生藥及薄層鑒別作出規定;現有的關于酢漿草質量控制的研究中，也僅有對酢漿草中異牡荊素的定量研究[15]，且建立的指紋圖譜均未指認共有峰[16-17]。基于此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立了酢漿草的指紋圖譜，并同時測定了其中異牡荊素、當藥黃素的含量，旨在為其質量標準的完善提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate3000型HPLC儀，包括系統控制器、低壓梯度組件、溫控樣品室、輸液泵、脫氣組件、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Chromeleon 7.0色譜工作站（美國Thermo Fisher Scientific公司）;AE240型十萬分之一電子天平[梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司];Allegra64R型臺式冷凍離心機（美國Beckman公司）;KQ-5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;WP-UP-Ⅱ-20型超純水機（四川沃特爾科技發展有限公司）。

1.2 藥品與試劑

當藥黃素對照品（純度：≥98%）、異牡荊素對照品（純度：≥98%）均由貴州醫科大學貴州省藥物制劑重點實驗室自制;甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

12批酢漿草樣品（編號：S1～S12，貴州維康子帆藥業股份有限公司），經貴州醫科大學貴州省藥物制劑重點實驗室劉春花副教授鑒定為酢漿草科酢漿草屬植物酢漿草（O. corniculata L.）的干燥全草。酢漿草藥材信息來源詳見表1。

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ACE Excel-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%A→26%A;10～20 min，26%A→27%A;20～30 min，27%A→29%A;30～36 min，29 A→32.5%A;36～46 min，32.5%A→39%A;46～57 min，39%A→55%A;57～71 min，55%A→80%A;71～77 min，80%A→95%A）;流速：1 mL/min;柱溫：35 ℃;檢測波長：280 nm;進樣量：10 μL。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 取異牡荊素對照品、當藥黃素對照品各10 mg，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得異牡荊素、當藥黃素質量濃度分別為0.978、0.988 mg/mL的單一對照品貯備液。取上述異牡荊素對照品貯備液0.3 mL、當藥黃素對照品貯備液0.4 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制得含異牡荊素、當藥黃素質量濃度分別為0.0587、0.0790 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取酢漿草粉末（過50目篩）約1 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，加70%乙醇25 mL，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）處理30 min，取出，放冷，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，取上層液，置于離心管中以12 000 r/min離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。

2.1.4 精密度試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（編號：S2）適量，按“2.1.1”項下色譜條件進樣平行測定6次，以異牡荊素的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，19個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明方法精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（編號：S2）適量，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、24 h時，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以異牡荊素的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，19個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.1.6 重復性試驗 取酢漿草藥材樣品（編號：S2）粉末約1 g，共6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按 “2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以異牡荊素的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，19個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明方法重復性良好。

2.1.7 HPLC指紋圖譜的生成 取12 批酢漿草藥材樣品粉末，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按 “2.1.1”項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》進行HPLC 圖譜分析，詳見圖1、圖2。

2.1.8 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》，以12批酢漿草藥材樣品的HPLC 對照指紋圖譜為對照，進行整體相似度評價。結果，12 批酢漿草藥材樣品的相似度均大于0.89，表明各批酢漿草藥材樣品間化學成分一致性良好，詳見表2。

2.1.9 共有峰的指認及相關分析 12批酢漿草藥材樣品共有19個共有峰。通過與混合對照品HPLC圖譜（圖3B）比對，指認了2個共有峰，即8號峰為異牡荊素，9號峰為當藥黃素。其中異牡荊素響應值較高、分離度較好，故以此峰為參照，計算其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積，詳見表3、表4。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 同“2.1.1”項。

2.2.2 溶液的制備 混合對照品溶液的制備同“2.1.2”項;供試品溶液的制備同“2.1.3”項;以甲醇為空白對照溶液。

2.2.3系統適用性試驗 ? 取上述混合對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖3。結果，在該色譜條件下，空白對照對測定無干擾，各成分峰分離度較好，峰形對稱，理論板數按異牡荊素峰計不低于30 000。

2.2.4 線性關系考察 分別精密量取“2.1.1”項下異牡荊素對照品貯備液0.02、0.09、0.15、0.20、0.30、0.60 mL，當藥黃素對照品貯備液0.05、0.10、0.15、0.30、0.40、0.60 mL，置于6個5 mL量瓶內，分別用甲醇稀釋至刻度，制成系列混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸。結果，異牡荊素回歸方程為y=0.423 1x+0.707 9（r=0.999 4）、當藥黃素回歸方程為y=0.351 0x-0.469 1（r=0.999 2），表明異牡荊素、當藥黃素分別在質量濃度3.91～117.36、9.88～118.56 μg/mL范圍內線性良好。

2.2.5 定量限與檢測限考察 分別精密量取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，以甲醇為溶劑倍比稀釋，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，分別以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1計算定量限 、檢測限。結果，異牡荊素、當藥黃素的定量限分別為0.675、3.587 μg/mL，檢測限分別為0.205、1.087 μg/mL。

2.2.6 精密度試驗 分別精密量取“2.1.1”項下各單一對照品貯備液0.30 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，按“2.2.1”項下色譜條件進樣平行測定6次，記錄峰面積。結果，異牡荊素、當藥黃素峰面積的RSD分別為0.2%、0.2%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.2.7 穩定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S2），分別于室溫下放置0、3、6、9、12、24 h時，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，異牡荊素、當藥黃素峰面積的RSD分別為0.8%、1.1%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.2.8 重復性試驗 取酢漿草藥材（編號：S2）粉末約1 g，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品含量。結果，異牡荊素、當藥黃素的平均含量分別為0.524、0.724 mg/g，RSD分別為0.5%、0.9%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已知含量的酢漿草藥材（編號：S2）粉末約0.5 g，共6份，精密稱定，分別加入適量的“2.1.1”項下各單一對照品貯備液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表5。

2.2.10 樣品含量測定 取12批酢漿草藥材樣品粉末適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品含量，結果見表6。

3 討論

在前期預試驗中，筆者采用二極管陣列檢測器對樣品在190 ～400 nm范圍內進行紫外吸收掃描，發現檢測波長為280 nm時峰形較好，基線較平穩，故選擇280 nm為檢測波長。同時，本研究比較了乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液等流動相系統的分離效果，發現以甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫時，各成分峰分離度較好、峰形對稱，故選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相。 此外，本研究分別對不同提取溶劑（100%、70%、50%、20%甲醇和100%、70%、50%、20%乙醇）、提取方法（超聲提取和回流提取）、提取時間（15、30、60、90、120 min）進行了考察，發現在相同的色譜條件下，70%乙醇為提取溶劑時峰數較多、分離度較好、響應值較高，故選擇70%乙醇為提取溶劑;超聲提取和回流提取差異不明顯，考慮到環保節能、操作簡便等因素，最終選擇超聲提取;當超聲30 min時色譜峰數較多，且30 min后提取率[在考慮指紋圖譜整體色譜峰信息的同時結合異牡荊素、當藥黃素的提取率（以這兩個指標成分峰面積計）]無顯著增加，故選擇提取時間為30 min。

本研究結果顯示，12批酢漿草藥材樣品的相似度均大于0.89，相對保留時間RSD均小于0.5%，但樣品相對峰面積RSD較大，提示各批藥材樣品的化學成分一致性雖較好，但其含量存在差異，該結果與含量測定結果一致，其原因可能為酢漿草的生長可受環境、年限、采收時間、栽培等因素的影響[18]。

綜上所述，所建指紋圖譜可用于酢漿草藥材的質量控制;含量測定方法簡便、準確，可用于同時測定其中2種成分的含量。

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（收稿日期：2019-07-23 修回日期：2020-02-07）

（編輯：陳 宏）