管碟法測定萬州紅桔精油抑菌效果研究

向春艷 胡悅

摘 要：采用超聲波提取法提取萬州紅桔精油，通過管碟法測定紅桔精油對6種試驗菌的抑菌效果，用二倍稀釋法測得其最低抑菌濃度。結(jié)果表明：紅桔精油對6種試驗菌均有不同程度的抑制作用，其中對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑菌作用最強(qiáng)，對大腸埃希氏菌和短小芽孢桿菌的作用次之。阪崎腸桿菌、白色念珠菌和大腸埃希氏菌的最低抑菌濃度為12 μL·mL-1;短小芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為24 μL·mL-1。

關(guān)鍵詞：萬州紅桔;精油;抑菌效果

Abstract：Wanzhou tangerine essential oil was extraction by ultrasonic extraction， determination of bacteriostatic effect of essential oil of tangerine on 6 kinds of experimental bacteria by cylinder-plate method ， determination of the minimum inhibitory concentration by double dilution method. The results show that： the essential oil of tangerine inhibited the growth of six kinds of experimental bacteria in varying degrees， among them， Listeria monocytogenes has the strongest antibacterial effect， the effect on Escherichia coli and? Bacillus pumilus was the second. The minimum inhibitory concentrationfor Escherichia coli， Candida albicans and Escherichia coli was 12 μL·mL-1， and the minimum inhibitory concentration of Bacillus pumilus， Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus was 24 μL·mL-1.

Key words：Wanzhou tangerine; Essential oil; Antibacterial effect

中圖分類號：S666.2

柑橘（Citrus reticulate Blanco）是蕓香科植物。萬州紅桔古稱丹桔，是柑橘屬的一個重要品種，是中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品。紅桔皮中含有揮發(fā)油，可制備精油，有研究表明，柑橘精油具有很好的抑菌效果[1-2]，

廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、煙酒制品、醫(yī)藥制品等行業(yè)[2]。在當(dāng)代食品行業(yè)，為了保證食品不被微生物污染，添加防腐劑、保鮮劑等仍是最常用的手段，但化學(xué)添加劑的蓄積會對人體造成健康風(fēng)險，而取材天然的橘皮精油，不僅具有良好的抗菌作用，安全性也非常高，可用于開發(fā)新型抑菌劑，未來市場前景非常好。本實驗以萬州紅桔皮為原料提取精油，通過管碟法測量萬州紅桔精油對大腸埃希氏菌等6種試驗菌的抑菌作用，確定最低抑菌濃度，為今后開發(fā)萬州紅桔新產(chǎn)品，提高紅桔產(chǎn)業(yè)的綜合應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸埃希氏菌（ATCC25922）、阪崎腸桿菌（CMCC45401）、短小芽孢桿菌（CMCC63202）、金黃色葡萄球菌（CMCC26003）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（ATCC19115）以及白色念珠菌（ATCC10231）均來源于廣東省微生物菌種保藏中心。

萬州紅桔購自重慶市萬州區(qū)滬萬農(nóng)貿(mào)市場。

營養(yǎng)瓊脂（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）;改良馬丁瓊脂（青島海博生物技術(shù)有限公司）;石油醚（30～60 ℃，分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）;氯化鈉（分析純，重慶川東集團(tuán)有限公司）;95%乙醇（分析純，重慶川東集團(tuán)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（AB204-S，梅特勒-托利多國際貿(mào)易上海有限公司）;電熱恒溫水浴鍋（SSY-H，上海三申醫(yī)療

器械有限公司）;立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZH-100KBS，上海申安醫(yī)療器械公司）;生物安全柜（BHC-1300ⅡA2，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9272型，上海益恒實驗儀器有限公司）;霉菌培養(yǎng)箱（MJ-150-I，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 紅桔精油的提取

稱取新鮮破碎的萬州紅桔果皮15.0 g，加入60 mL石油醚，浸泡30 min，80 W超聲功率下超聲60 min，過濾，濾液置蒸發(fā)皿中于60 ℃恒溫水浴鍋中揮發(fā)干溶劑，得到紅桔精油。

1.3.2 紅桔精油抑菌試驗

①培養(yǎng)基及試劑的制備。分別配制營養(yǎng)瓊脂、改良馬丁瓊脂、生理鹽水備用。②菌懸液的制備。細(xì)菌接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，于36 ℃下培養(yǎng)，真菌接種于改良馬丁瓊脂斜面，于28 ℃下培養(yǎng)，24 h后取出，用無菌生理鹽水洗下菌苔，經(jīng)平板計數(shù)后得到菌含量約為4.0×107 CFU·mL-1的6種菌懸液，備用。③管碟法測定抑菌圈。吸取6種待測菌懸液各0.1 mL，均勻涂布于相應(yīng)的瓊脂平板上，靜置5 min，等待菌液吸收。取無菌鑷子將內(nèi)徑為6 mm的4個滅菌小鋼管置于平板上，2個加15 μL紅桔精油原液，另2個加15 μL無菌生理鹽水作為空白對照，每種菌做3個平板，蓋上陶瓦蓋，置于適宜的溫度下培養(yǎng)24 h。測量抑菌圈直徑，取平均值作為結(jié)果。④最低抑菌濃度（MIC）的測定。用50%乙醇將紅桔精油的體積濃度稀釋成6、12、24、48μL·mL-1與96 μL·mL-1[3-4]，備用。吸取6種待測菌懸液各0.1 mL，均勻涂布于相應(yīng)瓊脂平板上，靜置5 min，等待菌液吸收。取無菌鑷子將6個滅菌小鋼管置于平板上，1個小鋼管加入15 μL的50%乙醇作為空白對照，另5個分別加入上述5種稀釋后的紅桔精油各15 μL，蓋上陶瓦蓋，置于適宜的溫度下培養(yǎng)24 h。測量抑菌圈直徑，最小抑菌圈對應(yīng)的體積濃度即為該菌的MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈直徑測定結(jié)果

由表1可知，本實驗所用紅桔皮精油對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌和短小芽孢桿菌的抑制作用較強(qiáng)，其抑菌圈直徑均在10 mm以上，而對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌的抑制作用較弱，抑菌圈的直徑均在10 mm以下。

2.2 最低抑菌濃度（MIC）測定結(jié)果

根據(jù)表2可知，當(dāng)精油體積濃度為6 μL·mL-1時，對短小芽孢桿菌完全沒有抑制作用，對其余5種試驗菌稍有抑制作用，但不明顯;當(dāng)體積濃度為12 μL·mL-1時，對大腸埃希氏菌、阪崎腸桿菌和白色念珠菌有明顯的抑制作用;當(dāng)體積濃度達(dá)到24 μL·mL-1時，才能對金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和短小芽孢桿菌產(chǎn)生抑菌作用。

3 討論

目前抑菌效果的測定常用紙片法，本實驗參考管碟法測定藥品抗生素效價，用小鋼管代替紙片，能準(zhǔn)確定量加入的精油，操作簡單易行，能有效保障試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本實驗所加入的精油量為15 μL，能剛好潤濕直徑為6 mm的濾紙片，菌體含量比陳林林[5]等的研究中高，這可能是導(dǎo)致本實驗中抑菌圈直徑相對較小的原因之一。

本實驗所用萬州紅桔皮精油采用超聲波輔助提取法制取，今后可考慮采用不同方法提取，并做成分分析及抑菌試驗，為有效利用精油開發(fā)產(chǎn)品提供有力的理論支撐[6]。

參考文獻(xiàn)：

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[2]崔佳韻，梁建芬.柑橘屬植物果皮精油抑菌作用研究進(jìn)展[J].糧油食品科技，2018，26（1）：35-39.

[3]韓 林，夏 兵，丁博等.川佛手精油抗氧化及抑菌活性的研究[J].中國調(diào)味品，2014，39（12）：55-62.

[4]徐 蜜.檸檬草精油成分分析與抑菌活性研究[D].長沙：中南林業(yè)科技大學(xué)，2015.

[5]陳林林，米 強(qiáng)，辛嘉英.柑橘皮精油成分分析及抑菌活性研究[J].食品科學(xué)，2010，31（17）：25-28.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（四部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.