冬棗新病害匍柄霉葉斑病病原菌的分離鑒定

雷早娟 武亞明 安鵬天

摘要 ? ?從冬棗葉斑病的樣品上分離到菌株L3-1-1，依據其形態學特征、rDNA-ITS序列分析結果以及致病性試驗，將其鑒定為匍柄霉屬真菌，能導致冬棗匍柄霉葉斑病。

關鍵詞 ? ?匍柄霉屬;形態學;ITS基因

中圖分類號 ? ?S436.65 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）04-0099-02 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract ? ?A fungus L3-1-1 was isolated from the pathogenic leaves of Dongzao jujube，and identified as Stemphylium sp. according to the morphological characteristics of the colony，ITS sequence and pathogenicity test results.L3-1-1 can cause leaf spot disease of Dongzao jujube.

Key words ? ?Stemphylium Wallroth;morphology;ITS gene

冬棗又名蘋果棗，屬于鼠李科棗屬，含有19種氨基酸及多種維生素，營養價值豐富，是一種受人青睞的果品，市場前景廣闊[1]。隨著人們消費觀念的轉變，國內外對冬棗的需求日漸增加，冬棗的種植面積和發展規模不斷擴大。與此同時，其生態環境發生了改變，隨之也出現了許多問題，其中最嚴重的是病蟲害。

匍柄霉屬真菌是一類常見真菌，可引起多種植物病害。截至目前，世界上已報道有150種匍柄霉屬病原菌，我國記載的有40種以上[2]。本文對冬棗新病害匍柄霉葉斑病病原菌進行分離鑒定，以期為匍柄霉葉斑病的科學防治提供參考。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗材料

冬棗匍柄霉葉斑病病樣，于2019年6月采自河北省黃驊市冬棗大棚;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）。

1.2 ? ?試驗方法

1.2.1 ? ?冬棗匍柄霉葉斑病的癥狀觀察。采集發病冬棗葉片進行觀察，詳細記錄并描述病斑大小、形狀、顏色、危害部位等。

1.2.2 ? ?病原物的分離與培養。釆用組織分離法，將病葉病健交界處剪成小塊兒表面消毒后放于PDA培養基上進行培養，等到組織塊兒周圍有菌絲產生后，將菌絲挑到新的PDA培養基上，得到純化的分離物。

1.2.3 ? ?病原菌形態學觀察。定期觀察該菌在PDA培養基上的菌落形狀、顏色、生長速度等;將病原菌從培養基上刮下，并制成臨時玻片，放置于在生物顯微鏡下觀察記錄病原菌的菌絲、分生孢子等形態，并測量大小。

1.2.4 ? ?致病性試驗。將病原菌在PDA上培養7 d后，用無菌水制成菌體懸浮液，采用離體葉片穿刺接種方法進行致病性驗證。用消毒后的解剖針穿刺冬棗葉片，然后在穿孔上滴上孢子懸浮液，以無菌水作對照。設3個重復，然后在28 ℃黑暗條件下保濕培養24 h[3]，7d內觀察記錄發病癥狀，對出現典型癥狀的葉片再次進行病原菌分離。

1.2.5 ? ?PCR擴增和序列分析。將分離菌株在PDA上培養7 d后，用消毒后的接種針刮取0.5 g菌絲體置于離心管中備用?；蚪MDNA通過試劑盒法提取。分別使用ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）引物對分離物的rDNA-ITS基因進行PCR擴增。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠跑電泳后測序。PCR產物送天津金唯智生物科技有限公司進行雙向測序。所得序列進行校正拼接后與GenBank數據庫中已知序列進行比對，并采用MEGA 7.0.14軟件中的鄰接法構建系統發育樹[4]。

2 ? ?結果與分析

2.1 ? ?冬棗匍柄霉葉斑病癥狀

試驗結果表明，冬棗匍柄霉葉斑病對冬棗新葉和老葉均可造成危害，從冬棗葉尖開始侵染并發病，形成褐色不規則形的病斑（圖1），使冬棗葉片從頂端開始脫水壞死，后期干枯脫落。

2.2 ? ?病原菌形態學特征

分離物L3-1-1在PDA培養基上生長較慢。菌落較厚，呈地毯狀生長，圓形，中央、邊緣分別呈現灰色、白色，邊緣不整齊，背面中央黑褐色，邊緣淺褐色。菌絲呈叉狀分枝，有分隔，淡褐色，光滑（圖2）。

2.3 ? ?致病性測定

接菌7 d后，冬棗葉片上出現褐色圓形病斑，葉片背面病斑顏色稍淺，病斑易破裂。對照組未見發?。▓D3）。對接種后的病斑再次進行病原菌分離，得到和原分離菌株一致的病原菌[5-6]。根據柯赫氏法則，證明接種菌株為冬棗匍柄霉葉斑病病原菌。

2.4 ? ?ITS序列分析

利用rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4對分離物L3-1-1的基因組DNA進行擴增，PCR產物送天津金唯智生物科技有限公司進行測序，校正拼接后獲得565 bp的序列。序列在NCBI上進行Blast比對分析，結果顯示，分離物L3-1-1與Stemphylium sp.（LC317797.1）序列的相似性為100%，采用MEGA 7.0.14軟件進行系統發育分析，發現分離物L3-1-1與Stemphylium sp.在同一個分支，且Bootstrap支持率為100%（圖4）。說明該分離物為匍柄霉屬真菌。

3 ? ?結論與討論

匍柄霉屬真菌在蔬菜上造成危害的報道較常見，尤其是2002年以來，匍柄霉屬真菌危害作物的報道日益增多。杜公福等[2]于2013年報道了萵苣、菜豆、茄子、苦瓜、菠菜等多種海南省冬季北運蔬菜的匍柄霉葉斑病。薛峰[5]、張天宇[6]陸續報道了匍柄霉屬的中國新種及新記錄種。

本研究結果可為診斷、了解匍柄霉葉斑病的發生規律以及病害防治等提供一定的參考。由于各種原因，本文未觀察到分離物L3-1-1產生的孢子，故不能結合形態學特征鑒定到種，后期還將繼續研究誘導其產孢的方法，努力將其鑒定到種。需注意的是，本病害在實際生產中很容易被認為是干旱缺水導致的葉尖枯萎的生理性病害。

4 ? ?參考文獻

[1] 孫蕾，王太明，鮑曉明，等.冬棗漿胞病病原微生物的分離與鑒定[J].山東林業科技，2010，40（5）：14-19.

[2] 杜公福，周艷芳，石延霞，等.海南省冬季北運蔬菜匍柄霉葉斑病病原的鑒定[J].植物保護，2013，39（2）：122-127.

[3] 方仲達.植病研究方法[M].3版.北京：中國農業出版社，1998.

[4] 系統發育樹的構建方法[J].微生物學報，2012，52（10）：1296.

[5] 薛峰.暗色絲孢真菌細基格孢屬（Ulocladium）、葡柄霉屬（Stemph-ylium）及鏈格孢屬（Alternaria）的分類和分子系統學研究[D].泰安：山東農業大學，2005.

[6] 張天宇.中國真菌志·第三十一卷·暗色磚格分生孢子真菌26屬（鏈格孢屬除外）[M].北京：科學出版社，2009.