自噬調節EMT過程在間質性肺病中的作用機制探討

徐存來　潘炯偉　金元虹

[摘要] 目的 研究不同階段肺泡Ⅱ型上皮細胞自噬變化，并通過增強自噬水平，觀察自噬對間質性肺炎上皮細胞-間充質轉化（EMT）的作用與調控機制。 方法 將小鼠隨機分為A空白對照組、B模型組、C自噬增強組各10只。B組及C組氣道滴注BLM建立模型，C組腹腔注射mTOR-siRNA。各組分別于干預第7天及第14天隨機處死3只小鼠，第28天處死剩下的4只小鼠。記錄每只小鼠體重。各組取肺組織進行電鏡檢查，計數肺泡Ⅱ型上皮細胞自噬體數量，測定不同時期的小鼠肺泡組織中的Smad3、Smad7表達。 結果 模型7 d組自噬體有所增加，模型14 d、28 d組較空白對照14 d、28 d組無明顯變化;自噬增強組各時間組可減輕小鼠肺泡炎及纖維化程度;第14、28 d比較：自噬增強組小鼠Smad3蛋白表達較肺間質纖維化模型組明顯降低（P<0.01），較空白對照組小鼠增高（P<0.01）;自噬增強組 Smad7 蛋白表達較肺間質纖維化模型組增加（P<0.05），相比空白對照組低（P<0.01）。自噬增強組的各階段的肺泡炎和肺纖維化程度與模型組（B組）對比減輕（P<0.05）（除肺纖維化7 d組比較外）。 結論 肺泡Ⅱ型上皮細胞的自噬變化對 EMT 具有重要調控作用，mTOR-siRNA可通過調節Smad 信號通路參與 EMT 過程的發生，減少肺間質纖維化形成。

[關鍵詞] 間質性肺疾病;自噬;肺泡 Ⅱ 型上皮細胞;上皮細胞-間充質轉化

[中圖分類號] R563? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）03-0030-05

[Abstract] Objective To study the changes of autophagy in alveolar type Ⅱ epithelial cells at different stages， and to observe the effect and regulation mechanism of autophagy on epithelial-mesenchymal transition（EMT） of interstitial pneumonia via enhancing autophagy level. Methods Mice were randomly divided into blank control group A， model group B and autophagy enhancement group C， with 10 mice in each group. Models of airway drip BLM were established in group B and group C. Group C was injected intraperitoneally with mTOR-siRNA. Three mice were randomly sacrificed on the 7th and 14th day of intervention in each group. On the 28th day， the remaining 4 mice were sacrificed. The body weight of each mouse was recorded. The lung tissue was collected for electron microscopy in each group. The number of autophagosomes in alveolar type Ⅱ epithelial cells was counted， and the expression of Smad3 and Smad7 in mice alveolar tissues at different stages was determined. Results The autophagosomes in the 7-day model group were increased， and the 14-day and 28-day model groups did not change significantly compared with the 14-day and 28-day blank control groups. The degree of alveolitis and fibrosis in mice could be alleviated in the autophagy enhanced group at each time; the comparison of 14 th and 28 th day： the expression of Smad3 protein in the autophagy enhanced group was significantly lower than that in the pulmonary interstitial fibrosis model group（P<0.01）， which was higher than that in the blank control group（P<0.01）; the expression of Smad7 in the autophagy enhanced group was higher than that in the model group at each stage（P<0.05）， which was lower than that in the blank control group （P<0.01）. The degree of alveolitis and pulmonary fibrosis at each stage in the autophagy enhanced group was reduced compared with the model group（group B）（P<0.05）（except the comparison of pulmonary fibrosis at 7th day）. Conclusion Autophagy changes in alveolar type Ⅱ epithelial cells have important regulatory effects on EMT. mTOR-siRNA can participate in the development of EMT by regulating the Smad signaling pathway and reduce the formation of pulmonary interstitial fibrosis.

[Key words] Interstitial lung disease; Autophagy; Alveolar type Ⅱ epithelial cells; Epithelial-mesenchymal transition（EMT）

間質性肺病（Interstitial lung disease，簡稱ILD）是一類主要累及肺臟間質，以炎癥及纖維化為主的疾病，其病理基本改變是肺泡炎及肺間質纖維化，最常見的癥狀是漸進性呼吸困難[1]。目前而言，間質性肺炎病因復雜，機制尚未完全明了，當間質性肺病后期發展到肺纖維化后常缺乏有效的治療辦法，既往常用的抗炎、抗氧化、抗凝或擴張肺部血管藥物如糖皮質激素、N-乙酰半胱氨酸、吡非尼酮、尼達尼布、西地那非和華法令等均無法從根本機制上阻止或改善損傷與修復異常[2];同時大規模臨床研究也表明，這些藥物不能給患者帶來肺功能和生存獲益，相反，部分藥物甚至存在遠期不良反應[3]。因此，從損傷與修復異常的調控機制入手，深入探索間質性肺纖維化中參與這一過程的重要靶點，對于尋找新的和有效的肺纖維化防治方法、改善預后將具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

從溫州醫科大學基礎醫學院實驗動物中心購買8周齡、體重約25 g雄性清潔級C57BL/6 小鼠（SPF級）30只，隨機分為A空白對照組、B模型組、C自噬增強組各10只，標準飼料分籠飼養，相對濕度35%～40%、室溫維持在22℃～23℃、每12小時照明交替一次，各組小鼠間無飲食或飼養環境區別。處理實驗小鼠的一切程序均按照《實驗動物的指導意見》。

1.2 博萊霉素（BLM）誘導的小鼠肺纖維化的模型建立

取20只小鼠腹腔注射速眠新注射液0.1 mL稀釋后注射，仰臥于動物臺上，2 mg/kg劑量的BLM溶于生理鹽水中抽取1 mL進行快速滴注，另外空白對照組10只小鼠則給予等量生理鹽水。滴畢，快速直立并旋轉小鼠使藥液分布均勻。

1.3 藥物干預自噬水平變化

1.3.1 分組干預? 自造模第2天起，每天向空白對照組小鼠（A 組）腹腔注射生理鹽水1 mL;每天向模型組小鼠（B 組）腹腔內注射生理鹽水 1 mL。每天向自噬增強組（C組）腹腔注射2 mg/kg的mTOR-siRNA 1 mL。各組分別于干預第7天及第14天用隨機數表法隨機處死3只小鼠，第28天處死剩下的4只小鼠，以干預因素和處死時間分為：空白對照7 d組（A1組），空白對照14 d組（A2組），空白對照28 d組（A3組），模型7 d組（B1組），模型14 d組（B2組），模型28 d組（B3組），自噬增強7 d組（C1組），自噬增強14 d組（C2組），自噬增強28 d組（C3組）。

1.3.2 siRNA慢病毒表達載體的構建? 根據 Genebank序列，構建靶向 mTOR、LC3基因siRNA真核質粒表達載體并驗證;利用慢病毒包裝系統，構建慢病毒載體，并擴增、純化、鑒定。

1.4 肺組織病理學分析

各組取小鼠新鮮肺組織，以20 cmH2O壓力向肺組織內灌注10%中性甲醛，將肺組織置入10%中性甲醛中24 h，常規石蠟包埋和切片，行 HE染色、Masson 染色。遵循盲法原則，請我院病理?？漆t師按照 Ashcroft方法進行肺泡炎癥及纖維化評分。

1.5 組織冰凍切片免疫熒光染色與TUNEL測定

取小鼠新鮮肺組織，OCT包埋，冰凍連續切片，貼附于聚賴氨酸包被好的載玻片上，-80℃保存待用。染色時取出，先后經 PBS、PBST漂洗后，小牛血清封閉，一抗孵育過夜，熒光二抗孵育，PBS 漂洗等過程后，以中性甘油封片，共聚焦顯微鏡觀察并拍照。取冰凍組織切片，按照 Tunel 試劑盒（DeadEndTM Fluorometric TUNEL System，Promega，USA）說明操作。

1.6 透射電鏡取材

取小鼠新鮮肺組織，取小塊置于石蠟平面，滴2.5%戊二醛溶液于組織表面，快速將組織切成1 mm×1 mm×1 mm左右的小塊約5～6 塊，浸入2.5%戊二醛固定后送透射電鏡檢測。肺泡 Ⅱ型上皮細胞的判定可根據其特征性板層小體，自噬體在電鏡下呈位于細胞質中的雙層膜結構。

1.7 肺組織膠原、羥脯氨酸水平測定

取小鼠新鮮肺組織于液氮速凍，-80℃保存待用。測定時取出，按照 Sircol collagen assay（Biocolor，UK）、羥脯氨酸測試盒（南京建成生物工程研究所）說明操作。

1.8 免疫組化染色（S-P 法）操作步驟

Smad3、Smad7免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物公司，具體操作按照說明書進行。

1.9 統計學處理

全部統計分析計算均在Windows10 SPSS21.0軟件中進行，計量資料以（x±s）表示，多組資料對比首先行正態分布檢驗及方差齊性檢驗，通過后再進行單因素方差分析。使用秩和檢驗進行多組等級資料統計分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組肺泡Ⅱ型上皮細胞自噬體數量比較

各組分別取肺組織進行電鏡檢查，計數肺泡Ⅱ型上皮細胞自噬體數量，發現模型7 d組與空白對照7 d組比較，差異有統計學意義（P<0.01）;自噬增強各組肺泡Ⅱ型上皮細胞自噬體數量與相應時間空白對照組比較，差異有統計學意義（P<0.01）。見封三圖2及表1。

2.2 增強自噬對BLM誘導的小鼠肺間質纖維化結局的影響

各組小鼠28 d處死后取組織行H&E，Masson病理染色與評分。結果發現，mTOR-siRNA可減輕小鼠肺泡炎及纖維化程度。見封三圖 3、4。

2.3 各組不同時間的肺泡炎及肺纖維化分級半定量比較

各時間自噬增強組和模型組與空白對照組比較均有顯著性差異（aP<0.01）;自噬增強組與相應時間模型組比較P值如下，僅自噬增強7 d組與模型7 d組比較無統計學差異（dP=0.061>0.05），其他組均有統計學差異（bP<0.01，cP=0.01，eP=0.019，fP=0.012），見表2。

2.4 各組小鼠不同時間的肺勻漿中羥脯氨酸含量結果比較

各組羥脯氨酸表達與相應時間段空白對照組比較均有統計學差異（aP<0.01）;自噬增強組第7天時與模型組比較無顯著性差異（bP=0.171>0.05）;第14、28天時自噬增強組較模型組升高（cP<0.01），見表3。

2.5 各組小鼠不同時間肺組織中 Smad3 蛋白的表達水平比較

各組與相應時間空白對照組Smad3 蛋白表達比較均有顯著性差異（aP<0.01）;自噬增強組與模型組比較，第7天無顯著性差異，第14、28天有顯著性差異（bP=0.177>0.05，cP<0.01），見表4。

2.6 各組小鼠不同時間Smad7的表達情況比較

各組與相應時間空白對照組Smad7的表達水平比較均有顯著性差異（aP<0.01）;自噬增強組與模型組比較第7天無顯著性差異，第14、28天有顯著性差異（bP=0.557，cP=0.039，dP<0.01），見表5。

3 討論

肺間質纖維化被認為是一種異常的病理生理學進程，過多的細胞外基質導致肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷，最終引起纖維瘢痕組織形成，臨床上表現為肺功能的不可逆損傷[4]。調查顯示，歐洲肺間質纖維化的發病率和死亡率逐年升高，但有效的治療方法仍較少[5]。間質性肺病治療中以IPF（特發性肺纖維化）較為困難，因IPF 的確切病因不清，且預后極差，中位生存時間僅2～3 年，5年生存率僅20%～30%[6-7]，目前當間質性肺病后期發展到肺纖維化后缺乏有效的治療辦法且合并細菌感染預后較差[8-10]。

自噬是一種保護機制，LPS 可引起肺組織中某些細胞發生自噬[11]。目前已證實，自噬在心、腎、肝纖維化的發生發展具有重要意義，通過調節自噬水平變化可改變纖維化程度[12-14]。在肺動脈高壓中，缺氧肺血管自噬體增多，LC3B-/-小鼠在慢性缺氧環境下肺動脈壓力指數增高，提示自噬具有保護作用[15];因此我們認為，自噬在IPF 中也可能扮演重要角色。

肺炎上皮細胞-間充質轉化（EMT）是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質細胞表型的生物學過程。目前，在乳腺癌、原發性肝癌的研究中已初步發現自噬參與調節 EMT 過程的依據[16]。目前國內外研究發現肺間質纖維化發病過程中，上皮細胞損傷導致局部組織的炎癥反應和缺氧環境促使EMT發生。其中，TGF-β被認為是特發性肺纖維化中誘導EMT發生的關鍵因子[17]。TGF-β與上皮細胞跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶Ⅰ、Ⅱ型受體結合，主要通過激活 Smad通路，使Smad2/3磷酸化并與Smad4結合進行核轉位，使上皮細胞表型向間充質細胞表型轉化。目前，在乳腺癌及原發性肝癌的研究中已初步發現自噬參與調節EMT過程的依據。通過饑餓誘導人肝癌細胞株HepG2、BEL7402自噬水平上調可通過TGF-β/Smad途徑誘導間充質細胞標記表達增加、上皮標記表達減少，從而促進 EMT發生、腫瘤轉移[18]。

近年來有研究證實敲除Smad3基因的小鼠和野生型小鼠采用致炎因子處理后有明顯不同的肺纖維化改變及膠原蛋白沉積，提示在 TGF-β1信號傳導通路調控肺纖維化發生過程中Smad3蛋白起到一部分的作用[19]，提示Smad蛋白是TGF-β1的信號轉導分子和轉導途徑的下游轉錄因子，其異常表達在肺纖維化中起著關鍵作用[20]。TGF-β1的信號通路簡單描述如下：TGF-β1首先與TGF-β1受體結合，使受體磷酸化Smad2/3，然后磷酸化的Smad2/3與Smad4結合，形成Smad2/3-Smad4二聚體進入肺泡Ⅱ型上皮細胞細胞核[18]，影響有關靶點基因的表達情況。而Smad7作為TGF-β1信號傳導通路中起抑制作用的蛋白，起到負反饋調節的功能[21]。

RNA 干擾技術通過體外合成短雙鏈小干擾 RNA（siRNA）轉入細胞，可高效、特異地抑制細胞內特定基因的表達。目前技術相當成熟，已被用于病毒性疾病、遺傳性、腫瘤性疾病的治療研究。目前針對調節自噬的藥物與試劑主要有：雷帕霉素、氯喹、3-甲基腺嘌呤（3-MA）等。本研究實驗結果：與模型組相比，自噬增強組第14、28天肺纖維化分級減低，結果有顯著性差異（P<0.05）;根據實驗結果，與模型組小鼠相比，自噬增強組（mTOR-siRNA組）羥脯氨酸含量在第14、28天時顯著降低，上述結果說明mTOR-siRNA 對博來霉素所誘導的小鼠肺纖維化模型有明顯抑制作用。造模成功后的模型組在第7、14、28天時的Smad3蛋白表達都較空白對照組顯著升高，并呈時間依賴性，有顯著性差異（P<0.01），提示 Smad3蛋白可能參與博來霉素誘導的小鼠肺纖維化過程中肺泡炎癥損傷及膠原蛋白的沉積。另外我們的研究結果也顯示與模型組比較，自噬增強組第14、28天的Smad3蛋白表達量均有所下降，有顯著性差異（P<0.01），而自噬增強組Smad7表達量逐漸降低，第14、28天與模型組相比較具有顯著性升高（P<0.05）;以上數據顯示在疾病發生發展過程中伴有Smad7的低表達，解除了對TGF-β1/Smad通路中Smad3因子的抑制，而mTOR-siRNA可能通過自噬抑制Smad3高表達、同時通過促進通路中發揮負性調控作用的Smad7的高表達來進一步調控TGF-β1/Smad通路促纖維化發生的作用。本次研究僅涉及動物實驗及組織學水平研究，具體機制仍有待蛋白及基因水平進一步證實。上述結果提示mTOR-siRNA能發揮抗纖維化作用與其調控Smad蛋白表達有關，可進一步用于機制研究與新藥開發，為間質性肺病的治療帶來新契機。

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（收稿日期：2019-04-15）