水稻轉基因成分快速檢測方法基層應用分析

丁寧

摘要 ? ?水稻轉基因越來越多地被廣大群眾所關注，農業(yè)農村部保持遏制非法轉基因的高壓態(tài)勢，轉基因成分檢測成為縣區(qū)級一項常規(guī)性檢測任務，如何在速測過程中確保檢測結果的準確性，避免假陽性或者假陰性成為基層工作者亟待解決的問題。本文重點介紹了基層主要檢測轉基因成分分類、安全性、現(xiàn)場穩(wěn)定性、靈敏度、檢測原理、檢測步驟及應用，以確保結果的準確性、有效性和可比較性。

關鍵詞 ? ?水稻;轉基因;快速檢測

中圖分類號 ? ?S188 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

水稻是江蘇第一大糧食作物，水稻質量安全問題對保障老百姓生活至關重要。對于水稻的轉基因工作，2009—2018年每年農業(yè)部辦公廳都發(fā)布關于開展農業(yè)轉基因生物安全監(jiān)管檢查工作的通知，要求開展轉基因監(jiān)測工作;各省市每年都下發(fā)進行農業(yè)轉基因生物監(jiān)管工作的通知，開展轉基因成分快速檢測工作。從法律層面來講，《農業(yè)轉基因生物安全評價管理辦法》（2017年11月30日修訂版）第三十二條明確縣級以上地方各級人民政府農業(yè)行政主管部門負責本行政區(qū)域內的農業(yè)轉基因生物安全的監(jiān)督管理工作[1];《農產品質量安全監(jiān)管項目資金管理辦法》第二章第四條規(guī)定農產品質量安全監(jiān)管項目資金主要用于單獨列出農業(yè)轉基因安全管理，轉基因安全例行監(jiān)測及生產環(huán)境安全長期監(jiān)測;行政執(zhí)法、跨區(qū)監(jiān)管及重點地區(qū)轉基因安全專項檢查[2]。宿遷市是蘇北糧食生產大市，全市水稻種植面積21.47萬hm2，品種多、亂、雜的局面沒有完全改變。為了確保農業(yè)轉基因生物安全，防止轉基因水稻非法生產，保護生態(tài)環(huán)境，保障市民健康，開展水稻轉基因檢測，確保水稻生物安全性尤其重要，提升基層轉基因工作監(jiān)管能力成為亟待解決的問題。

1 ? ?水稻轉基因成分分類

1.1 ? ?抗蟲轉基因

目前，在農業(yè)生產上使用比較多的是抗蟲轉基因和抗除草劑轉基因，抗蟲基因主要有Bt殺蟲基因的cry1Ab、cry1Ac、cry1C和cry2A等十幾種[3]，Cry1Ab和Cry1Ac是目前在作物轉基因抗蟲育種上應用最多的一類Bt殺蟲蛋白，可以特異性地毒殺二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟等水稻鱗翅目害蟲，殺蟲效果十分理想。

1.2 ? ?抗除草劑轉基因

抗除草劑基因具有耐除草劑草甘膦特性的CP4 EPSPS、耐除草劑甲胺磷的特性的bar基因、抗除草劑溴苯腈基因（bxn基因）等，草甘膦是世界上使用范圍最廣的除草劑，其除草的作用機理是通過抑制莽草酸途中的EPSPS合酶，阻礙芳香族氨基酸的合成，擾亂植物正常的氮代謝而使其死亡[4-5]。

1.3 ? ?抗病轉基因

張長偉[6]將苦瓜幾丁質酶基因McCHIT1、苜蓿防御素基因alfAFP及其雙價基因成功地導入水稻恢復系縉恢35中，得到了一批對稻瘟病、紋枯病抗性明顯增強的植株后代。

1.4 ? ?抗逆性轉基因

抗逆性轉基因有耐冷、耐干旱、耐鹽堿、耐淹等各類為了提高水稻品質而引入的抗逆性基因。

1.5 ? ?市面上主要轉基因品種

目前，市面上存在的轉Bt基因抗蟲水稻有TT51-1（bt63）、Ⅱ優(yōu)科豐6號、克螟稻和耐除草劑轉基因水稻LLRICE62和LLRICE601等，是各基層監(jiān)管單位進行監(jiān)管的主要對象。

2 ? ?轉基因安全性

據陳友倩等水稻轉基因及其安全性研究進展介紹，轉基因存在抗藥性、過敏性、產生有毒物質、營養(yǎng)價值不良影響、生物多樣性等安全性問題。

3 ? ?轉基因速測卡現(xiàn)場穩(wěn)定性和靈敏度

何 ?景等在轉基因速測卡的現(xiàn)場應用性能及其可行性研究中得出，Cry1Ab/1Ac速測卡靈敏度最低可達0.25%，無交叉反應性，與Real-time PCR標準方法比對驗證，同時對5種模擬實際樣品進行檢測分析，檢測結果一致，能夠滿足達到準確檢測的目的，適用于轉基因成分的現(xiàn)場快速檢測，檢測靈敏度為100 μg/kg。

4 ? ?轉基因成分速測原理

轉基因速測的主要原理為利用雙抗體夾心法，首先將轉基因蛋白特異的抗體，偶聯(lián)于顯色試劑，并摻入試紙條，當試紙條被插入含有轉基因蛋白的植物組織的少量萃取物時，偶聯(lián)抗體與蛋白之間就發(fā)生了結合，與偶聯(lián)于顯色試劑上的某些但不是全部抗體形成夾心物。膜片含有2個捕獲區(qū)，一個捕獲區(qū)可捕獲結合的轉基因蛋白，另一個捕獲區(qū)可捕獲顯色試劑。當夾心物和未反應的顯色試劑被膜片上的特定區(qū)捕獲時，這些捕獲區(qū)就顯現(xiàn)出紅色。若膜片上僅存在1條紅色對照線，說明受檢樣品為陰性樣品;若存在2條線，說明受檢樣品為陽性樣品[4-5]。

5 ? ?轉基因成分檢測步驟

5.1 ? ?取樣

對區(qū)域內品種展示區(qū)、制種區(qū)、雜交稻種植區(qū)等進行集中采集，采集時做好GPS定位，并做好抽樣單的填寫。取樣具體要求為取水稻葉片直徑1 cm左右的圓形葉片組織2片，放到2 mL刻度尖底離心管中，或者取磨碎后的過100目的水稻種子0.25 g，用記號筆標注樣品編號。

5.2 ? ?提取

每個水稻葉片樣品中加0.20 mL主要成分為磷酸的提取緩沖液，用力上下振蕩使樣品和緩沖液充分接觸混合，用玻璃棒搗碎，顏色變綠時可以準備檢測;如果取樣為水稻種子，則加主要成分為磷酸的提取緩沖液0.75 mL進行溶解，蓋好蓋子，進行上下振蕩提取20～30 s，為了確保樣品與緩沖液充分混勻，靜置一段時間等待固體物質沉淀在管底，待上面澄清后就可以作為測試液進行測定，提取樣品時要小心操作，避免交叉污染。

5.3 ? ?測定

速測試紙恢復至常溫，放于水平桌面上，用槍吸75 μL蛋白樣品上清液于底端或者將速測試紙按照箭頭方向直接插入樣品上清液中，試紙浸沒入0.5 cm，不要超過箭頭上端黑色標記線，從上樣開始倒計時，結果在5～8 min內讀取，否則判讀無效，取出的速測紙要盡快使用，避免環(huán)境對速測紙產生不利影響。

5.4 ? ?結果判斷

陰性樣品T線不顯色;陽性樣品T線顯色肉眼可見;無效樣品顯示為未出現(xiàn)T線上部的C線。

5.5 ? ?注意事項

一是在4～10 ℃條件下進行避光干燥保存，不能冷凍，試紙的有效期為12個月，拆封1 h內盡快使用，溫度高于30 ℃或高濕度條件下要做到即開即用。二是樣品中固體雜質顆粒會導致假陰性結果，取樣時靜置取上清液進行檢測，必要時進行離心取上清液做檢測。三是采用水稻植株樣品進行轉基因檢測時，只需要變綠即可，不用太碎，液體太綠容易在條上吸附葉綠素，導致假陽性問題。

6 ? ?轉基因速測應用

每年僅宿豫區(qū)轉基因檢測就至少有53個水稻品種，轉基因速測具有用時短（只需要10～15 min）、操作簡單、檢測結果穩(wěn)定、準確度高等特點，具有良好的現(xiàn)場應用性能，能夠滿足基層對生物安全性監(jiān)測的要求。轉基因速測技術是基層農業(yè)轉基因監(jiān)管的重要手段，切實提高了監(jiān)管能力，同時持續(xù)強化研發(fā)、制種環(huán)節(jié)監(jiān)管，查早查小，嚴厲打擊違法違規(guī)行為，確保水稻生物安全性[6]。

7 ? ?參考文獻

[1] 農業(yè)部科技教育局.農業(yè)部關于進一步加強轉基因生物安全監(jiān)管工作的通知[EB/OL].（2010-06-06）[2019-10-12].http：//jiuban.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/tz/201006/t20100606_1533955.htm.

[2] 農業(yè)部關于印發(fā)《農產品質量安全監(jiān)管項目資金管理辦法》的通知[EB/OL].（2017-12-05）[2019-10-12].http：//jiuban.moa.gov.cn/sjzz/cws/fagui/201712/t20171205_5962970.htm.

[3] 吳振映，柳絮.利用農桿菌介導法獲得轉cry2A抗蟲基因水稻的研究[J].山東農業(yè)科學 2011（5）：1-3.

[4] 農業(yè)大省黑龍江明年5月起全面禁止轉基因作物[EB/OL].（2016-12-17）[2019-10-12].http：//news.sohu.com/20161217/n476141506.shtml.

[5] 阮先樂，張杰.轉基因成分的檢測方法綜述[J].江蘇農業(yè)科學，2017，45（5）：12-15.

[6] 張長偉.轉McCHIT1、alfAFP基因及其雙價基因水稻的稻瘟病和紋枯病抗性研究[D].重慶：西南大學，2011.