胡椒堿氨基酸衍生物的合成及表征

王艷麗，王斌鋒，馬苗苗，張秀娟，崔 箭

（1.中央民族大學民族醫(yī)藥教育部重點實驗室，藥學院，北京 100081；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)生物技術(shù)研究院，特色植物分子生物學重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010070；3.銅川市人民醫(yī)院，陜西銅川 727000）

胡椒堿（Piperine）又名1-胡椒酰哌啶（1-Piperylpiperidine）（結(jié)構(gòu)式見圖1），屬于桂皮酞胺類生物堿，具有降血脂、抗腫瘤、抑制寄生蟲病、抗胃潰瘍、抗氧化、抗炎癥、抗白癜風和抗腦血管痙攣等作用[1-5]。分子式為C17H19NO3，化學結(jié)構(gòu)式見圖1。早在1819年，Oersted 等首次從胡椒中提取得到了一種黃色結(jié)晶狀物質(zhì)胡椒堿，它是胡椒中含量最大的生物堿，是胡椒的主要辛辣成分，也是胡椒中活性最高的成分。我們通過前期的研究發(fā)現(xiàn)胡椒堿具有一定的降脂作用，但因毒性較大，水溶性差導致其生物利用度低，限制了其臨床應(yīng)用開發(fā)，所以對其進行化學結(jié)構(gòu)的改造，用以降低胡椒堿的毒性，增加其生物利用度。因此，通過水解、酰胺化反應(yīng)，固相水解等過程得到氨基酸酯修飾的胡椒堿氨基酸衍生物，為后續(xù)的藥理研究提供實驗原料。

圖1 胡椒堿的結(jié)構(gòu)式

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

胡椒堿：純度＞95%，陜西泰克生物科技有限公司；L-纈氨酸乙酯鹽酸鹽：純度＞98%，上海研拓生物科技有限公司；二氯亞砜（SO2Cl2）、中性氧化鋁（Al2O3）：75～150μ m；二氯甲烷（DCM）：分析純、三乙胺（TEA）：分析純；石油醚（PE）：分析純；甲醇，無水乙醇，氟化鉀（KF），乙酸乙酯（EA）：分析純，鹽酸：分析純，碳酸氫鈉：分析純，氫氧化鉀（KOH）：分析純，Sigma-Aldrich 公司。

硅膠板60F254，Merck；核磁共振儀Advance 400，Bruker；高效液相色譜D-2000 Elite，Hitachi；電子天平PL2002，Mettler Toledo；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-2100，Eyela；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器ETS-D5，IKA；真空泵VG130，SPECK。液質(zhì)聯(lián)用儀AB SCIEX TripleTOF?5600 系 統(tǒng)，AB SCIEX Technologies，美國。

1.2 實驗方法

胡椒堿氨基酸衍生物的合成路線見圖2。

圖2 胡椒堿氨基酸衍生物的合成路線

Scheme 1 Reagents and conditions：（i）KOH，ethanol，reflux，12h ；HCl（ii）SOCl2，DCM，reflux，12h（iii）DCM，（2a-2j），Et3N，rt，2h（iv）KF-Al2O3，50℃，2h

1.2.1 胡椒酸的合成

胡椒堿（64g，219.9mmol），加入95%乙醇（1.5L），攪拌情況下加入氫氧化鉀白色固體（113.5g，17.9mmol），加熱攪拌回流12h，TLC 跟蹤檢測至原料反應(yīng)完全。靜置冷卻，減壓抽濾，將濾餅用無水乙醇洗三次至pH=7左右，減壓抽濾，于50℃時干燥12h，得棕褐色胡椒酸鉀鹽晶體。將烘干后的胡椒酸鉀鹽用水溶解，此時溶液為棕黃色透明液體，減壓抽濾，除去不溶物，濾液用鹽酸（1 ∶1）酸化至pH=1～2，產(chǎn)生淡黃色黏稠狀液體，靜置，抽濾，濾餅用去離子水洗至中性后抽濾，濾餅于烘箱中90℃時干燥24h，得到淡黃色固體。

1.2.2 胡椒酸氨基酸酯化合物的合成

胡椒酸（2.18g，10mmol），加入干燥的二氯甲烷溶解，然后加入二氯亞砜（73.8mmol，14.4mL），氮氣保護加熱回流2h，減壓蒸餾得到胡椒酸酰氯固體。將得到的胡椒酸酰氯溶解在干燥的二氯甲烷中，隨后加入氨基酸酯（20mmol）攪拌溶解，在0℃條件下緩慢加入三乙胺，室溫攪拌，TLC 跟蹤反應(yīng)，反應(yīng)完成加入水，有機層用水（2*25mL）萃取，然后用無水硫酸鈉干燥，得到粗產(chǎn)物。

粗產(chǎn)物純化：將粗產(chǎn)物盡量少的溶解在乙酸乙酯中，然后緩慢加入正己烷，直至溶液變渾濁，室溫靜置得到胡椒酸氨基酸酯晶體。

1.2.3 胡椒酸氨基酸類化合物的合成

質(zhì)量分數(shù)40% KF-Al2O3的制備：將15g 中性氧化鋁和10g KF 分散于200mL 水中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上50～60℃下除去水，放入真空烘箱中50℃干燥12h，置于干燥器中備用。

胡椒酸氨基酸的制備：取胡椒酸氨基酸酯（1.65mmol，0.5g）與KF-Al2O3（3.13mol，40% KF）混合，在小表面皿中研磨分散。將分散均勻的粉末轉(zhuǎn)移至50mL 的茄型瓶中，在50℃加熱攪拌3h。冷卻后將5mL 水加至固相體系中，攪拌5min。過濾，將濾液用質(zhì)量分數(shù)10%鹽酸酸化，過濾，干燥后得黃色固體粉末。

2 結(jié)果與討論

2.1 胡椒酸的表征

（2E，4E）-5-（benzo[d][1，3]dioxol-5-yl）penta-2，4-dienoic acid（b），淡黃色固體。

Data for b：Yield 85%.1H NMR（DMSO-d6，400MHz）：δ5.93（d，1H，J=15.5Hz），6.05（s，2H）；6.91～6.98（m，3H），7.01（dd，1H，J=1.5Hz，J=8.0Hz），7.23（d，1H，J=1.5Hz），7.27～7.34（m，1H）。

13C NMR（DMSO-d6，101MHz，）δ101.8，106.2，108.9，121.6，123.5，125.3，130.9，140.1，145.1，148.4，148.5，167.2.LC-MS calculated for C12H10O4expected[M]：218.2；found[M+H]+：219.2。

2.2 胡椒酸纈氨酸乙酯的表征

ethyl 2-（（2E，4E）-5-（benzo[d][1，3]dioxol-5-yl）penta-2，4-dienamido）-3-methylbutanoate（3），白色固體。

Datafor 3（見 圖3）：Yield80.45%.1HNMR (DMSO-d6，400 MHz) δ 7.35 (dd， J = 14.9， 10.6 Hz， 1H)， 6.96 (s， 1H)，6.87 (dd， J = 8.1， 1.7 Hz， 1H)， 6.79 - 6.61 (m， 3H)， 6.08 (d， J= 8.9 Hz， 1H)， 5.99 (s， 0H)， 5.96 (s， 2H)， 4.66 (dd， J = 8.8， 4.9 Hz， 1H)， 4.20 (qq， J = 7.0， 3.6 Hz， 2H)， 2.19 (pd， 1H)， 1.28 (t，J = 7.1 Hz， 3H)， 0.94 (dd， J = 12.6， 6.9 Hz， 6H)。

圖3 胡椒酸纈氨酸乙酯13C NMR圖

13C NMR (DMSO-d6， 101 MHz) δ 172.31， 166.00， 148.38，148.30， 141.83， 139.34， 130.89， 124.64， 122.76， 122.71，108.57， 105.85， 101.40， 61.37， 57.13， 31.70， 19.01， 17.94，14.31. LC-MS calculated for C19H23NO5 expected [M]： 345.4；found [M+H]+： 346.2。

圖4 胡椒酸纈氨酸乙酯1H NMR圖

2.3 胡椒酸纈氨酸的表征

2-（（2E，4E）-5-（benzo[d][1，3]dioxol-5-yl）penta-2，4-dienamido）-3-methylbutanoic acid（13），黃色固體。

Data for 13（見圖5）：Yield 59.58%.1H NMR（400MHz，）

δ7.35（dd，J=14.9，10.6Hz，1H），6.96（s，1H），6.87（dd，J=8.1，1.7Hz，1H），6.79 - 6.61（m，3H），6.08（d，J=8.9Hz，1H），5.99（s，0H），5.96（s，2H），4.66（dd，J=8.8，4.9Hz，1H），4.20（qq，J=7.0，3.6Hz，2H），2.19（pd，1H），1.28（t，J=7.1Hz，3H），0.94（dd，J=12.6，6.9Hz，6H）。

圖5 胡椒酸纈氨酸乙酯13C NMR圖

13C NMR（101MHz，DMSO-d6）（ 見 圖6）：δ173.70，165.99，148.48，148.29，140.45，138.71，131.37，125.71，124.64，123.25，108.98，106.23，101.80，57.85，30.41，19.73，18.67.LC-MS calculated for C17H19NO5 expected[M]：317.3；found[M+H]+：318.1。

圖6 胡椒酸纈氨酸乙酯1H NMR圖

3 結(jié)論

胡椒堿的基本骨架是通過酰胺連接至側(cè)鏈的堿性六元哌啶組成，側(cè)鏈由雙鍵和亞甲基二氧苯基（MDP）部分組成。具體合成方法為：首先胡椒堿用乙醇、KOH 水解得胡椒酸，然后再利用二氯亞砜將胡椒酸轉(zhuǎn)化為胡椒酰氯，然后在二氯甲烷中與不同的氨基酸酯的胺基部分縮合，從而得到胡椒酸纈氨酸乙酯，這些化合物的結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過氫譜、碳譜及質(zhì)譜的確認。整個合成過程采用了重結(jié)晶的純化方式，減少了柱層析分離方式，最后一步采用了固相水解的方式，既保護了結(jié)構(gòu)中的酰胺鍵，又避免了溶劑得過多的使用，實現(xiàn)了化合物的綠色合成。