癌基因AVIL在肝癌中的表達(dá)及其預(yù)后分析

林 玥， 劉紅梅， 謝裕安

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院,實(shí)驗(yàn)研究部，南寧 530021)

肝細(xì)胞癌是消化道常見腫瘤，在原發(fā)性肝癌中約占90%[1]。肝癌起病隱匿，探究早期診斷的生物標(biāo)志物，可以為診斷和評(píng)估肝癌患者預(yù)后提供有價(jià)值的信息[2]。溶膠蛋白超家族是一類鈣離子依賴性肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，在生理和病理細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其通過調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[3]。凝溶膠蛋白超家族成員中幾大核心成員如凝溶膠蛋白(GSN)[4]、絨毛膜蛋白(Villin)[5]、加帽蛋白(CapG)[6]是潛在的腫瘤標(biāo)志物，這一觀點(diǎn)已經(jīng)得到中外研究證實(shí)[7]。Advillin(AVIL)是凝溶膠蛋白家族的新成員，與凝溶膠蛋白家族成員共享6個(gè)凝溶膠蛋白同源(GH)結(jié)構(gòu)域，具有對(duì)肌動(dòng)蛋白捆綁、結(jié)合的功能[8]。前人對(duì)Advillin的研究主要集中在Advillin與Villin相似的序列方面[9]，而其在腫瘤中的研究鮮有報(bào)道。

為此，基于Advillin與Villin具有極其相似的序列和功能的前提下，推測(cè)AVIL是影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)新的生物標(biāo)志物，采用免疫組化驗(yàn)證的方法，分析AVIL基因在原發(fā)性肝細(xì)胞癌與癌旁組織的表達(dá)差異，探討其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性以及預(yù)后的關(guān)系，以期為肝細(xì)胞癌相關(guān)研究提供新的觀點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 病例資料

回顧性收集2013年10月—2016年12月于廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院行肝癌根治術(shù)并具有完整資料的76例原發(fā)性肝癌患者，所有病例手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為肝細(xì)胞性肝癌且固定于10%福爾馬林并行常規(guī)石蠟包埋，所有病例均無術(shù)前放療或化療等輔助治療史。所有標(biāo)本獲取過程均按照倫理程序，并獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 臨床資料

臨床分期根據(jù)BCLC分期進(jìn)行劃分。肝細(xì)胞癌分化程度分級(jí)采用的Edmondson分級(jí)法。

76例原發(fā)性肝癌組織中，男性66例，女性10例；年齡28～77歲，平均年齡53.2歲；有腫瘤家族史16例，無腫瘤家族史60例；臨床BCLC分期，A～B期50例，C期26例；腫瘤直徑<5 cm者26例，≥5 cm者50例；病理Edmondson分級(jí)，I～I(xiàn)I期41例，III～I(xiàn)V期35例；伴有癌栓者36例，無癌栓者40例；腫瘤多灶性35例，無多灶性者例41例；伴有AFP<8.04 ng/mL者26例，8.04 ng/mL者50例；伴有ALT<40 U/L者48例，40 U/L者28例；伴有AST<37 U/L者35例，37 U/L者41例；伴有γ-GT<50 U/L者35例，50 U/L者41例；伴有HBsAg者68例，無HBsAg者8例；伴有肝硬化者48例，無肝硬化者28例；腫瘤轉(zhuǎn)移患者19例，非轉(zhuǎn)移患者57例。同時(shí)選取對(duì)應(yīng)的76例癌旁組織作為對(duì)照。

隨訪結(jié)束截至2019年3月12日，其中死亡患者23例；失訪2例；存活51例。將死于肝癌記為終點(diǎn)事件，其他情況則記為截尾事件，生存時(shí)間均按月計(jì)算。

1.3 主要試劑與儀器

兔抗人AVIL單克隆抗體(1∶150)購自英國(guó)Abcam公司；即用型SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；PBS磷酸鹽緩沖液(粉劑)、檸檬酸抗原修復(fù)液(干粉)、蘇木素購自福建邁新生物技術(shù)有限公司；中性樹脂、二甲苯、多濃度梯度乙醇、烤箱等均由廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部提供。

1.4 免疫組化染色及結(jié)果判讀

采用免疫組化SP法(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法)對(duì)石蠟切片組織進(jìn)行檢測(cè)，具體操作方法按照試劑說明書進(jìn)行。結(jié)果判讀：每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野下計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，根據(jù)染色細(xì)胞百分率計(jì)分標(biāo)準(zhǔn):0 分為≤10%，1 分為11%～25%，2 分為26%～50%，3 分為51%～75%，4 分為>75%；染色強(qiáng)度的計(jì)分標(biāo)準(zhǔn):無著色計(jì)為0 分，淺棕色計(jì)為1 分，棕色計(jì)為2 分，深棕色計(jì)為3 分。上述兩項(xiàng)分值之和判斷其結(jié)果:0 分為陰性(-)，2 ～ 3分為弱陽性(+)，4 分為中度陽性(++)，5 ～ 6 分為強(qiáng)陽性(+++)。得分≥4分為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和分析，兩組表達(dá)差異以及表達(dá)水平與臨床參數(shù)間關(guān)系均采用χ2檢驗(yàn)。生存曲線采用Kaplan-Meier法、Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞癌與癌旁中組織中AVIL的表達(dá)水平

AVIL蛋白主要表達(dá)于肝細(xì)胞癌組織中，其在肝細(xì)胞癌中陽性率為64.5%，而在配對(duì)癌旁組織中多為低表達(dá)，陽性率僅為43.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.779，P=0.009<0.05)，如表1、圖1所示。

表1 AVIL在肝癌及配對(duì)癌旁組織中的蛋白表達(dá)水平

注：*表示該值P<0.01。

圖1 AVIL基因在肝細(xì)胞癌和癌旁組織中的蛋白表達(dá)水平

2.2 AVIL表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者臨床參數(shù)之間的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，AVIL表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者BCLC分期、Edmondson分級(jí)有關(guān)(P<0.05)，而AVIL表達(dá)與患者性別、年齡、有無腫瘤家族史、腫瘤大小、AFP、ALT、AST、γ-GT、HBsAg、有無癌栓、有無多灶性、有無肝硬化、有無轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05，表2)。相比臨床早期(BCLC-A～B期)的患者，AVIL蛋白表達(dá)在臨床晚期(BCLC-C期)患者中的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。相比病理分級(jí)低(Edmondson I～I(xiàn)I期)的患者，AVIL蛋白表達(dá)在病理分級(jí)高(Edmondson III～I(xiàn)V期)患者中的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，如表2所示。

表2 AVIL差異表達(dá)水平與肝癌患者各臨床參數(shù)之間的關(guān)系

注：**表示采用Fisher精確概率法；△表示該值P<0.05。

2.3 AVIL表達(dá)與肝癌患者生存時(shí)間的關(guān)系

將免疫組化染色的76例肝癌樣本根據(jù)其表達(dá)值劃分成AVIL低表達(dá)(<4分)組和AVIL高表達(dá)(≥4分)組，采用Kaplan-Meier生存分析法，結(jié)果表明，AVIL蛋白高表達(dá)組肝癌患者的生存時(shí)間顯著低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如圖2所示。單因素分析表明，AVIL表達(dá)水平、BCLC分期、腫瘤大小、有無癌栓、有無多灶性、AFP、AST、γ-GT、有無肝外轉(zhuǎn)移與肝細(xì)胞癌癌患者預(yù)后相關(guān) (P<0.05),患者的年齡、性別、有無腫瘤家族史、Edmondson分級(jí)、ALT、HBsAg、有無肝硬化等與患者預(yù)后無顯著相性。多因素分析結(jié)果表明，多發(fā)子灶是肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因(P=0.043)，而AVIL表達(dá)水平、BCLC分期、腫瘤大小、有無癌栓、AFP、AST、γ-GT、有無肝外轉(zhuǎn)移并不是影響預(yù)后的獨(dú)立因素，如表3所示。

圖2 AVIL基因不同表達(dá)水平對(duì)肝癌患者生存時(shí)間的影響

3 討論

AVIL定位于染色體區(qū)域12q14，蛋白分子質(zhì)量為92 kD[10]。其編碼的蛋白最初是通過篩選小鼠腦cDNA文庫中鑒定發(fā)現(xiàn)的凝溶膠蛋白家族新成員，因其氨基酸序列與同屬于凝溶膠蛋白家族的Adseverin和絨毛蛋白(Villin)分別有65%和75%的高度同源性而被命名為Advillin[11]。凝溶膠蛋白是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，具有對(duì)肌動(dòng)蛋白捆綁、結(jié)合和維持性質(zhì)的功能，在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用，包括腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等過程[12]。Advillin與凝溶膠蛋白家族成員共享6個(gè)凝溶膠蛋白同源(GH)結(jié)構(gòu)域，以及含有與Villin相似的羧基末端頭部結(jié)構(gòu)(cHP)[9]。cHP是決定肌動(dòng)蛋白捆綁能力的重要區(qū)域，具有與F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合的功能[13]。

表3 肝癌患者的Cox單因素及多因素分析

注：多變量模型中僅納入單變量模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量；▽表示該值P<0.05, ▲▲表示該值P<0.01。

AVILmRNA主要在成人胃腸道、骨骼肌中表達(dá)，在其他組織表達(dá)水平非常低[14]，其中在胎兒腸中最低。AVIL具有調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的能力，其可以通過產(chǎn)生片狀偽足和局灶性粘連，影響調(diào)控足細(xì)胞遷移率(PMR)[15]，一旦AVIL發(fā)生隱性突變會(huì)降低體外蛋白質(zhì)的肌動(dòng)蛋白成束能力，使足細(xì)胞功能的喪失誘導(dǎo)腎病綜合癥的發(fā)生[8]。研究發(fā)現(xiàn)，AVIL是一種促進(jìn)纖毛生成的調(diào)節(jié)劑，它能切斷肌動(dòng)蛋白絲來調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白組織進(jìn)而控制纖毛的長(zhǎng)度[16]。多年來，人們對(duì)AVIL編碼的Advillin蛋白了解主要圍繞其是一種感覺神經(jīng)元特異性肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白。許多研究反復(fù)證實(shí)， Advillin與神經(jīng)突生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)生以及軸突再生密切相關(guān)[17-18]，其豐富表達(dá)于背根神經(jīng)節(jié)之中[19]。Chuang等[20]在患有疼痛性周圍神經(jīng)病的小鼠的腦脊液中檢測(cè)到由Advillin蛋白，并認(rèn)為其是診斷周圍神經(jīng)病變的生物特征。同家族成員Villin，已被證實(shí)與多種消化道腫瘤具有明確的相關(guān)性[21]。李峰等[22]研究發(fā)現(xiàn)Villin在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯高于正常肝組織，認(rèn)為其可能作為一種癌基因參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。然而，AVIL(Advillin)在腫瘤中的相關(guān)研究仍較空白。為了更多了解凝溶膠蛋白超家族蛋白在腫瘤的表達(dá)及功能，將AVIL作為腫瘤標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)的潛力。基于AVIL與Villin具有極其相似的結(jié)構(gòu)和功能，推測(cè)其可能是一個(gè)新的腫瘤標(biāo)志物。

通過免疫組化法分析可知，AVIL主要在癌組織中高表達(dá)陽性率達(dá)64.5%，表明AVIL(Advillin)作為凝溶膠蛋白家族中的成員之一，可能與同家族成員Villin相似，在肝癌發(fā)生過程中能發(fā)揮促癌的作用[23]。肝癌的分期對(duì)判斷患者預(yù)后十分重要。晚期原發(fā)性肝癌總體預(yù)后差，多數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)報(bào)道中位生存期均小于1年[24]。目前，對(duì)原發(fā)性肝癌晚期范圍界定一直比較模糊。BCLC分期中將處于BCLC-C期的患者定義為晚期，肝癌晚期的患者存在多發(fā)子灶或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療難度大，預(yù)后較差。結(jié)果表明，AVIL高表達(dá)的患者，臨床分期更差、病理分級(jí)更高(P=0.032、P=0.033)，其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。因此，AVIL表達(dá)水平可能用于肝細(xì)胞癌惡性程度及患者預(yù)后趨勢(shì)的評(píng)估。

通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，AVIL低表達(dá)患者的術(shù)后生存時(shí)間明顯高于高表達(dá)患者。Cox單因素表明，AVIL表達(dá)水平、BCLC分期、腫瘤大小、有無癌栓、有無多灶性、AFP、AST、γ-GT、有無肝外轉(zhuǎn)移都是影響患者生存時(shí)間的相關(guān)因素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。將上述9個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的單因素代入Cox多因素分析，結(jié)果表明，多發(fā)子灶可作為預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后不佳的一個(gè)獨(dú)立因素(P=0.043)，此外，其余8個(gè)因素與預(yù)后有相關(guān)性，但不能作為影響肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。

綜上所述，AVIL可能是一個(gè)新的癌癥相關(guān)基因，它與原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展以及與肝癌患者的生存預(yù)后有密切聯(lián)系。AVIL高表達(dá)提示腫瘤惡性程度高、預(yù)后不佳，可能作為肝細(xì)胞癌患者有意義的生存期預(yù)測(cè)因子，但不作為一個(gè)判斷預(yù)后的獨(dú)立因素，同時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤多發(fā)子灶可作為判斷預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。由于目前只驗(yàn)證了部分臨床標(biāo)本，其在腫瘤中的機(jī)制及功能還不明確。肝癌的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞的活動(dòng)密切相關(guān)，表明存在大量調(diào)節(jié)細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，不能排除其他凝溶膠蛋白家族成員在過程中的影響。AVIL基因是否能作為一個(gè)有效的腫瘤標(biāo)志物，還有待進(jìn)一步研究和探索。

4 結(jié)論

(1)AVIL高表達(dá)提示肝癌患者惡性程度高、預(yù)后不佳，其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。

(2)AVIL是肝癌患者有意義的生存期預(yù)測(cè)因子，但不作為一個(gè)判斷預(yù)后的獨(dú)立因素。