牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277菌株外切聚磷酸酶的表達、純化和結晶

張愛莉， 盧作焜， 李蓉芳， 李文文

(許昌學院食品與生物工程學院，河南省食品安全生物標識快檢技術重點實驗室，許昌 461000)

多聚磷酸鹽(polyphosphate，polyP)由正磷酸殘基組成，其長度可達到上百個，在所有的真核和原核細胞中都能發現多聚磷酸鹽的存在[1-2]。在真核細胞中，polyP能夠顯著影響DNA損傷后的細胞修復[3]。在細菌中，polyP不僅參與嚴緊反應，還對增強牙齦卟啉單胞菌、結核分枝桿菌以及銅綠假單胞菌等病原菌的毒性、感染性、靜止期耐受性以及抗生素耐藥性等生理活動起著至關重要的作用[4-7]。因此，細胞中polyP濃度的調控對細菌的生長、存活、適應及感染等許多生理學過程十分重要。

外切聚磷酸酶(exopolyphosphatase，PPX)是細菌中水解polyP的主要蛋白[8]。研究發現PPX對幾種主要病原菌(如結核分枝桿菌和腦膜炎奈瑟氏菌)的致病機理、靜止期存活以及抗生素耐受性等必不可少[9]。同時，polyP與PPX在嗜熱金屬球菌的銅離子抵抗中具有重要作用[10]。PPX蛋白屬于外切聚磷酸酶/鳥苷五磷酸磷酸水解酶(PPX/GppA)家族蛋白。目前，針對PPX/GppA蛋白家族的研究主要集中在該家族蛋白的生理學重要性，而關于其結構的研究尚鮮見報道，僅2種PPX/GppA同源蛋白的結構被報道，分別是來源于超嗜熱菌的PPX蛋白和大腸桿菌的PPX蛋白[11-13]，而來源于運動發酵單胞菌(Zymomonasmobilis)的PPX/GppA同源蛋白的野生型、截短體和活性位點突變體的X射線晶體學研究近期也被報道[14]，亟待進一步深入研究該家族蛋白。

引起成人牙齒脫落的原因很多，其中最主要是牙周炎，牙周炎也是人類最經常發生的傳染性疾病之一[15-17]。而牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)是引起嚴重慢性牙周炎和侵襲性牙周炎的主要病原體[15]。研究表明，該病原菌的重組RgpB蛋白可以激活人口腔成齦纖維細胞的鈣離子通路[18]，其脂多糖能夠通過增加抗炎癥因子的生成來降低口腔不良反應[19]；Porphyromonasgingivalis也與類風濕性關節炎等多種系統性疾病相關[20]。此外，最新研究發現，引起阿爾茨海默癥的真正原因很可能是Porphyromonasgingivalis[21]。

PorphyromonasgingivalisATCC 33277菌株是牙齦卟啉單胞菌的模式菌株，其基因組僅含有一個編碼外切聚磷酸酶的基因PGN_0378，編碼的外切聚磷酸酶(PgPPX蛋白)由302個氨基酸殘基組成[22]。Porphyromonasgingivalis381的多聚磷酸激酶1(PPK1)蛋白能夠合成polyP，該蛋白基因的缺失會引起生物膜形成和靜止期存活的缺陷[4]。據此，并結合PPX蛋白在其他病原菌致病中的重要作用，可以推測PgPPX蛋白也與Porphyromonasgingivalis的致病性以及嚴緊反應等生理活動至關重要，該蛋白極有可能作為潛在的抗Porphyromonasgingivalis的藥物靶標。然而，目前關于Porphyromonasgingivalis中PPX/GppA家族同源蛋白PgPPX的表達與純化以及結構的報道仍處于空白。

為此，利用分子克隆技術對PorphyromonasgingivalisATCC 33277菌株的外切聚磷酸酶(PgPPX)的基因進行克隆和重組載體構建，表達、純化后對目的蛋白進行晶體生長與對比，以期后續對該致病菌中的外切聚磷酸酶進行X射線晶體學研究，對基于結構基礎的藥物設計提供一個起點，為更為有效地治療牙周炎提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

菌株與質粒：大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)， pGEX-6p-1質粒。

其他試驗材料及來源如表1所示。

表1 試驗材料

1.2 方法

1.2.1 重組表達載體的構建與轉化

以PorphyromonasgingivalisATCC 33277菌株為擴增模板，利用PCR技術對PgPPX的編碼序列PGN_0378進行擴增。采用T4 DNA連接酶將雙酶切后的目的基因片段連接至pGEX-6p-1載體，使表達的PgPPX蛋白序列N端具有谷胱甘肽硫轉移酶(GST)標簽和HRV3C蛋白酶酶切序列。提取質粒后鑒定擴增的重組質粒(由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成)。將正確克隆的重組質粒利用化學轉化法轉化至感受態大腸桿菌BL21中。基因PGN_0378的分子克隆信息如表2所示。

表2 分子克隆信息

1.2.2 PgPPX融合蛋白的表達

使用非代謝的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)在不同的濃度下誘導目的融合蛋白的過量表達，4 ℃預冷的PBS緩沖液(10 mmol/L Na2HPO4、2.7 mmol/L KCl、140 mmol/L NaCl、1.8 mmol/L KH2PO4，pH=7.4)懸起收集的菌體細胞，并采用超聲波細胞破碎儀破碎[23]。

1.2.3 PgPPX蛋白的純化

1.2.4 PgPPX結晶條件的篩選

采用坐滴氣相擴散法對晶體生長條件進行篩選[24-25]，所使用的結晶池液條件包括Hampton Research公司生產的Crystal Screen Kit I、II，Index，PEG/ION I、II，Salt Rx I、II，PEGRxI、II和Emerald BioSystems公司的Wizard I、II、III、IV等晶體生長試劑盒。

2 試驗結果

2.1 重組表達載體的構建和鑒定

通過PCR技術擴增PgPPX蛋白基因PGN_0378。重組質粒的DNA測序結果經過比對后表明，pGEX-6p-1載體中克隆入的外源目的基因序列與NCBI的Nucleotide庫中PGN_0378的DNA序列信息相吻合，一致性達到100%。說明已成功將PgPPX蛋白的基因構建到pGEX-6p-1載體中，得到重組質粒。

2.2 PgPPX蛋白的表達和純化

分別取HRV3C蛋白酶酶切前的柱上樣和酶切后的流穿樣制樣。由圖1可知，PgPPX-GST融合蛋白(泳道2，分子質量約為60 kDa)已被蛋白酶切開，洗脫的目的蛋白電泳條帶位置(泳道1)與預測的分子質量(33.7 kDa)接近。

圖1 融合蛋白GST親和層析后的13%SDS-PAGE檢測

PgPPX蛋白的陰離子交換層析圖譜如圖2所示，其中藍色曲線表示蛋白質在280 nm波長處的吸光值，棕色曲線表示線性NaCl的濃度梯度(Buffer B的混合百分比)。由圖2可知，PgPPX蛋白在離子強度梯度提高過程中形成了一個分布比較集中、對稱的洗脫峰，洗脫峰出現在29%Buffer B附近。離子交換層析圖譜表明PgPPX蛋白有較高的電荷均一性。

圖2 陰離子交換層析圖譜

SDS-PAGE電泳結果如圖3所示，表明PgPPX純度較前一步驟得到了進一步的提高。

圖3 陰離子交換層析后收集部分的13%SDS-PAGE檢測

PgPPX蛋白的凝膠過濾層析色譜圖如圖4所示，在14.3 mL附近有一個峰型較為對稱的目的蛋白洗脫峰，將其與標準樣品在Superdex200 10/300 GL凝膠過濾層析柱的洗脫圖譜進行比較，得知蛋白樣品洗脫峰對應分子質量約為67 kDa，表明PgPPX蛋白在此溶液中主要為二聚體形式。

圖4 凝膠過濾層析圖譜

凝膠電泳結果(圖5)表明，主要洗脫峰均為PgPPX蛋白，且純度已經達到95%以上。

圖5 凝膠過濾層析后收集部分的13%SDS-PAGE檢測

2.3 PgPPX蛋白的濃度鑒定

收集凝膠過濾層析后的目的蛋白洗脫峰進行超濾濃縮，利用Nanodrop超微量分光光度計檢測蛋白質濃度，結果表明，LB培養基的PgPPX表達量高達30 mg/L。

2.4 PgPPX結晶條件的篩選

晶體培養約7 d后，在顯微鏡下觀察到有3個條件中均有晶體長出，分別是PEG/ION的32號條件[0.2 mol/L MgSO4·6H2O、20% PEG3350(m/V)]，PEG/ION的39號條件[0.2 mol/L NaH2PO4·H2O、20% PEG3350(m/V)]和Wizard IV的29號條件[pH=4.0、0.1 mol/L C6H5Na3O7/C6H8O7,0.2 mol/L C6H5Na3O7，20% PEG3350(m/V)]，獲得的晶體如圖6所示，形狀分別為棍狀、針狀、薄片狀簇生。其中，PEG/ION-32條件下獲得的晶體形狀最好，為較粗的長棍狀，而其他兩個條件下獲得的晶體形狀不規則且為攣晶，這與在室內Rigaku MicroMax-007 HF旋轉陽極X射線衍射儀下的初步衍射結果一致。

圖6 篩選得到的晶體

3 討論

Porphyromonasgingivalis表現出一定的抗生素耐藥性，是造成最嚴重的抗生素耐藥問題的少數病原體之一[16]。除牙周炎之外[15-19]，大量研究表明Porphyromonasgingivalis還與類風濕性關節炎和阿爾茨海默癥等多種系統性疾病相關[20-21]。相比于骨關節炎，類風濕性關節炎患者，牙周炎的發病率更高，發病情況更加嚴重[26]。此外，Porphyromonasgingivalis能通過降低與B細胞激活相關的炎癥反應，進而抑制阿爾茨海默癥患者中的適應性免疫系統[27]；最新研究發現，阿爾茨海默癥患者的認知衰退越嚴重，其大腦中的Porphyromonasgingivalis數量越多；小鼠試驗證實了Porphyromonasgingivalis進入大腦后釋放的一種分泌蛋白才是導致阿爾茨海默癥的真正原因[21]。綜上所述，病原菌Porphyromonasgingivalis不容小覷，除病理學研究外，還急需對影響其生存、感染的蛋白質展開生化研究。

牙周炎患者牙周袋中惡劣的炎癥環境表明，Porphyromonasgingivalis一定有能力幫助其應對和適應外界的氧化、營養等壓力。由于病原菌抵抗外界環境壓力的嚴緊反應也是其致病性的關鍵因素之一。因此，應針對Porphyromonasgingivalis中和病理生理學以及嚴緊反應相關蛋白的結構和功能進行研究，以期為抗Porphyromonasgingivalis藥物的開發，以及有效預防和治療牙周炎奠定基礎。然而，至今關于Porphyromonasgingivalis中與病原菌的致病性、嚴緊反應和對抗生素耐藥起關鍵作用的PPX/GppA家族同源蛋白的表達、純化以及結構與功能的報道仍處于空白。

為此，通過對PorphyromonasgingivalisATCC 33277中編碼外切聚磷酸酶的基因PGN_0378進行重組載體構建和外源表達。利用GST親和層析純化融合蛋白后，切除GST標簽。由于蛋白質X射線晶體學的研究工作需要獲得大量的性質均一、穩定的目的蛋白，從而來進行蛋白質晶體的培養及優化。因此，依次采用3種層析技術對PgPPX蛋白進行了純化，成功得到了純度極高、性質均一的大量目的蛋白。

PgPPX蛋白的預測分子質量為33.7 kDa，而其凝膠過濾層析色譜圖表明PgPPX蛋白在此溶液中主要為二聚體形式。這種現象與其他PPX/GppA家組蛋白的情況一致，例如大腸桿菌PPX和GppA蛋白[12-13]以及運動發酵單胞菌(Zymomonasmobilis)的假定外切聚磷酸酶[14]。此結果有利于結構解析時進行晶體空間群的確定。

由PgPPX蛋白的晶體生長條件篩選結果可知，3種條件中均含有20% PEG3350(m/V)，說明該濃度條件下的PEG3350對PgPPX晶體的生長極其重要，而0.2 mol/L MgSO4·6 H2O影響晶體的形狀。后續需要采用坐滴法或篩選添加劑等方法依據PEG/ION-32的成分組成對PgPPX晶體進行進一步優化，以期獲得衍射能力更好的晶體，為后期對該致病菌中如此重要的外切聚磷酸酶進行結構和功能研究奠定基礎，并為基于結構基礎的抗牙周炎藥物設計提供一個起點。

4 結論

(1)構建載體PgPPX-pGEX-6p-1和轉化菌株BL21(DE3)-PgPPX-pGEX-6p-1，經過多種純化技術后得到純度、表面電荷性質和聚合狀態均一程度均較滿意的PgPPX蛋白，而且蛋白表達量高達30 mg/L。

(2)通過篩選條件，PgPPX在0.2 mol/L MgSO4·6 H2O，20% PEG3350(m/V)條件下獲得的晶體形狀較好，為后續的X-射線晶體學研究和蛋白酶活性測定試驗奠定了基礎。