中蜂與意蜂荔枝蜜揮發性成分的測定與對比分析

王桃紅，崔宗巖，張少博，賈光群，魏紅躍，李學民，張進杰，魏玉海，王向紅

（1.河北農業大學食品科技學院，河北保定071000；2.秦皇島海關技術中心，河北秦皇島066004；3.西寧海關技術中心，青海西寧810001）

荔枝蜜是以荔枝為蜜源植物釀造而成的，多產自我國華南地區[1]，如廣東、廣西、福建等省份。荔枝蜜呈淡琥珀色，質地濃稠，微酸，有微結晶現象，具有荔枝清香氣味[2-3]。荔枝蜜因蜂種的不同可分為中蜂荔枝蜜和意蜂荔枝蜜。蜂蜜的香氣主要與其揮發性組分有關[4-6]，主要類別是萜烯及其衍生物和苯的衍生物[5，7-9]等。已有研究對我國洋槐蜜[10-15]、油菜蜜[10，12，14，16-19]、荊條蜜[10-11，13]、棗花蜜[11，13，20-21]、椴樹蜜[10-12，14]等主要蜜種揮發性成分進行了報道。然而，國內外對荔枝蜜揮發性成分的報道較少，龍銀花等[22]采用循環氣提-樹脂吸附法采集荔枝蜜的香氣物質，共鑒定出14種化合物；Praetinee Pattamayutanon等[5]利用頂空固相微萃取氣質聯用（headspace solid phase microextraction，HS-SPMEGC-MS）技術分析泰國荔枝蜜中的揮發性有機化合物，共檢測出30種揮發性物質，其中芳樟醇氧化物為含量最高的成分。

本文研究采用頂空固相微萃取-氣相色譜質譜聯用技術（solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC/MS）分別對我國不同產地采集的18批荔枝蜜的揮發性成分進行檢測，對荔枝蜜的揮發性成分組成、不同蜂種荔枝蜜揮發性成分的差異進行系統分析和評價，可有效區分中蜂荔枝蜜和意蜂荔枝蜜。

1 試驗材料與方法

1.1 蜂蜜樣品

研究所用蜂蜜樣品均是在荔枝植物的開花流蜜季節（2018年3月～5月）采自中國華南地區。所有樣品直接從蜂農手中獲得，檢測前一直置于4℃條件下保存。其中中蜂荔枝蜜7份，意蜂荔枝蜜11份，驗證樣品中蜂和意蜂荔枝蜜各5份，詳細信息見表1。

表1 荔枝蜜樣品采集信息表Table 1 Information of collected honey samples

續表1 荔枝蜜樣品采集信息表Continue table 1 Information of collected honey samples

1.2 儀器設備

7890B-5977B型氣相色譜-質譜聯用儀（配置分流/不分流進樣口和固相微萃取專用襯管）、Agilent DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國 Agilent公司；MPS多功能樣品前處理平臺（配置自動化頂空固相微萃取手柄）：德國Gerstel公司。

1.3 試劑與材料

固相微萃取纖維：50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）、85 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS 和 65 μm PDMS/DVB 4 種不同涂層的纖維頭：美國Sigma-Aldrich Supelco公司；20 mL頂空瓶：德國Gerstel公司；配置硅膠/聚四氟乙烯隔墊、20 mm鐵蓋、壓蓋器、啟蓋器：德國CNW科技公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品處理和SPME條件

準確稱取（2.0±0.1）g蜂蜜樣品于20 mL頂空瓶中，加蓋密封后直接置于樣品前處理平臺上進行固相微萃取。

SPME條件：萃取纖維為50/30 μm DVB/CAR/PDMS；萃取溫度：60 ℃；平衡時間：20 min；震蕩速率：250 r/min；萃取時間：45 min；進樣口解析時間：5 min。

1.4.2 GC-MS條件

GC條件：進樣口溫度270℃，載氣為高純氦，流量1.0 mL/min，不分流進樣；升溫程序：初始溫度40℃，保持3 min，然后以3℃/min速率升至160℃，然后以10℃/min速率升至270℃，保持6 min。

MS條件：電子轟擊離子源（electron ionization，EI）70 eV；傳輸線溫度270℃；離子源溫度230℃；全掃描模式，掃描范圍為25～450 m/z。

1.4.3 定性定量方法

主要采用3種方法對目標化合物進行定性

1）將目標色譜峰對應質譜圖扣除背景空白后，進行NIST14譜庫檢索，正相和反相匹配度均在800以上，且相似度得分值最高的化合物，即認定為目標物，由柱流失帶來的硅氧烷類化合物不計在內；

2）對相似度得分接近而保留指數（retention index，RI）有明顯差異的化合物，通過參考其RI值進行定性；

3）部分同分異構體質譜圖相似，RI值差別也較小，則通過標準品進行保留時間驗證，最終確定檸檬烯保留時間（retention time，RT）（RT：15.90）、丁香醛 A（RT：21.52）、丁香醛 B（RT：21.92）、丁香醛 D（RT：22.59）和萜品烯-4-醇（RT：23.37）。

采用面積歸一化法測定樣品中揮發性成分的相對含量，對GC-MS總離子流色譜圖中目標峰進行積分和計算峰面積，每個目標峰的面積與總峰面積之比，即為該目標物的相對含量。除柱流失帶來的色譜峰之外，由樣品儲存介質帶來的增塑劑類（如鄰苯二甲酸酯等）色譜峰，也不計在目標峰內。

2 結果與討論

2.1 SPME參數選擇和優化

2.1.1 萃取纖維纖維的選擇

萃取纖維的選擇決定了萃取目標物的種類和數量。本研究考察了最常用的50/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS 和 65 μm PDMS/DVB 4種不同涂層的纖維對某代表性荔枝蜜揮發性成分的萃取效果。結果表明，DVB/CAR/PDMS、PDMS/DVB纖維萃取的數量分別為92、86種，CAR/PDMS、PDMS、PDMS/DVB 分別為60、71種。DVB/CAR/PDMS和PDMS/DVB纖維對蜂蜜揮發性成分萃取的數量要明顯多于另外兩種纖維，與Pearez R A[23]和Ceballos L[24]等報道一致。由于DVB/CAR/PDMS較PDMS/DVB纖維吸附揮發性成分的極性范圍更廣，在蜂蜜中揮發性成分的研究中應用更為廣泛[10，14，18，21]，因而本研究選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維。

2.1.2 萃取溫度的選擇

試驗考察 30、40、50、60、70 ℃的溫度下樣品中揮發性成分的萃取效果。結果表明，在不超過60℃條件下，隨著萃取溫度的升高，目標峰的總峰面積從1.24×109增加到1.45×109，響應值逐漸增高，60℃和70℃條件下大多數目標峰響應值變化不大，分別為1.45×109、1.42×109。由于溫度過高會使蜂蜜中部分揮發性成分發生變化，當超過70℃條件下羥甲基糠醛含量會升高[25]，而一般認為60℃以下蜂蜜的主要成分不發生明顯變化，因而選擇60℃為萃取溫度。

2.1.3 萃取時間的選擇

考察萃取時間為 10、20、30、45、60、90 min 條件下樣品中揮發性成分的萃取效果。結果表明，在不超過45 min條件下，隨萃取時間的延長，總峰面積從6.97×108到1.41×109，大部分揮發性成分的響應值逐漸增強，但當萃取時間再增加至60 min或90 min時，目標物響應值變化不大，分別為 1.39×109、1.40×109。為保證目標物具有較高的響應值同時節約分析時間，選取45 min為萃取時間。

2.2 荔枝蜜的揮發性成分

中蜂和意蜂荔枝蜜樣品的總離子流色譜圖見圖1。

在優化的試驗條件下，荔枝蜜中揮發性成分均得到良好的分離，18批荔枝蜜中共檢測出98種揮發性成分，中蜂和意蜂荔枝蜜中揮發性成分的相對含量見表2。

圖1 中蜂荔枝蜜和意蜂荔枝蜜揮發性成分總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in lychee honeys produced by Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

表2 中蜂和意蜂荔枝蜜中揮發性成分的相對含量Table 2 Amount of volatile compounds in lychee honeys produced by Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

續表2 中蜂和意蜂荔枝蜜中揮發性成分的相對含量Continue table 2 Amount of volatile compounds in lychee honeys produced by Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

續表2 中蜂和意蜂荔枝蜜中揮發性成分的相對含量Continue table 2 Amount of volatile compounds in lychee honeys produced by Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

由表2可知，中蜂荔枝蜜檢出93種，意蜂荔枝蜜檢出85種。荔枝蜜揮發性成分主要包括醇類、芳香族類、醛類、酸類、萜烯類、酮類、烷烴類、酯類等，另有15個目標峰未鑒定具體化合物種類（標記為未知峰）。

中蜂荔枝蜜和意蜂荔枝蜜揮發性成分種類比對如圖2所示。

由圖2可知，中蜂荔枝蜜的揮發性成分主要由萜烯類、醇類、醛類、酮類組成，這4類揮發性成分的含量占揮發性成分的86.29%。意蜂荔枝蜜的揮發性成分主要由萜烯類、醛類、酮類和芳香類組成，這4類揮發性成分的含量占揮發性成分的86.62%。中蜂和意蜂荔枝蜜中萜烯類物質相對含量均最高，分別占揮發性成分的64.65%和64.28%。醇類化合物在中蜂荔枝蜜中含量相對較高，占到揮發性成分的7.86%，而意蜂荔枝蜜中醛類化合物含量相對比較高，占揮發性成分的12.27%。

圖2 中蜂和意蜂荔枝蜜中揮發性成分的種類及相對含量Fig.2 Volatile compounds types and amount of lychee honeys produced by Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

所有樣品中含量最高的揮發性成分均為芳樟醇氧化物，中蜂荔枝蜜中平均含量占到51.40%，意蜂荔枝蜜中占37.56%，該結果與泰國荔枝蜜一致[5]。

2.3 中蜂和意蜂荔枝蜜揮發性成分對此分析

文獻報道不同蜂種的蜜蜂會對同一種蜜源植物的揮發性成分產生一定影響[5，26]。本研究進一步詳細對比了中蜂和意蜂荔枝蜜揮發性成分的異同，由表2數據可知，中蜂和意蜂荔枝蜜揮發性成分中共有成分為80種，占總揮發性成分的81.63%，說明不同蜂種荔枝蜜揮發性成分整體上相似，但二者也都存在各自的差異性成分。對比研究發現，庚醇、乙酸苯乙酯、正壬醇、丁香醇等化合物只在中蜂釀造的荔枝蜜中檢出，在意蜂荔枝蜜中未發現，且具有顯著性差異。而在意蜂釀造的荔枝蜂蜜樣品中，癸醛、環氧芳樟醇氧化物和某未知峰（RT：27.98）均檢出，中蜂荔枝蜜樣品中則均未出現，且具有顯著性差異。差異揮發性成分的含量見圖3，通過其異同可以有效區分中蜂和意蜂荔枝蜜，為不同蜂種釀造的荔枝蜜的鑒別提供了新的技術手段。

通過方差分析，進一步對結果進行驗證，試驗結果見表3。

由表可見，正庚醇、正壬醛、丁香醇、乙酸苯甲酯、癸醛、環氧芳樟醇氧化物和未知峰（RT：27.98）在中蜂和意蜂荔枝蜜中存在明顯差異，分別為中蜂和意蜂的差異性成分，可以對中蜂和意蜂進行區分鑒別。試驗結果可靠。

圖3 中蜂荔枝蜜和意蜂荔枝蜜中差異揮發性成分Fig.3 Different volatile compounds of lychee honeys produced by Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

表3 中蜂和意蜂荔枝蜜中差異揮發性成分相對含量Table 3 Amount of different volatile compounds in lychee honeys produced by Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

3 結論

采用頂空固相微萃取（HS-SPME）-氣質聯用（GC-MS）技術對我國不同產地采集的18批荔枝蜜的揮發性成分進行檢測，共檢測出98種揮發性成分，其中含量最多的均為萜烯類物質。正庚醇、正壬醇、乙酸苯乙酯、丁香醇僅在中蜂荔枝蜜被檢出，而癸醛、環氧芳樟醇氧化物和某未知色譜峰（RT：27.98）僅在意蜂荔枝蜜中被檢出。通過差異揮發性成分可以有效區分中蜂和意蜂荔枝蜜，為不同蜂種釀造的荔枝蜜的鑒別提供了新的技術手段。