山葵酸奶工藝及揮發性風味物質研究

羅倩，田計均，唐媛，余海萍，李瑞瑾，孫雁霞，，*

（1.民辦四川天一學院，四川綿竹618200；2.成都大學藥學與生物工程學院，四川成都610106；3.成都大學教務處，四川成都610106）

山葵（Wasabia japonica Matsum）是十字花科多年生宿根性喜陰草本植物，皮綠色，髓部偏白，肉質堅硬，磨碎后具有揮發性芒香辣味[1]。山葵含有豐富的氨基酸、維生素和人體所需的多種微量元素，其組織內存在芥子苷，在水解酶的作用下發生酶促水解，釋放出極易揮發的異硫氰酸酯，該物質具有殺菌抗癌、抗骨質疏松、抗肥胖、抗氧化、抗病毒、增強免疫力等多種保健作用[2-4]。目前以山葵為原料的加工產品主要有山葵葉茶[5]、山葵葉柄調味菜[6]、山葵抑菌口香糖[7]、山葵油米辣[8]、山葵調味醬[9]等，而將山葵應用于酸奶加工中的研究較少，其許多潛在價值尚未開發。

本試驗以山葵為原料，利用其中的特殊成分，研制出一種集山葵和酸奶的保健功能于一體且風味獨特的新型酸奶。以感官評價為指標，采用響應面法對山葵粉添加量、發酵劑接種量、白砂糖添加量、發酵時間進行優化，為山葵的開發提供新的思路，同時開辟乳品業的新市場。以普通酸奶為對照，采用頂空固相微萃取技術（high space solid phase micro-extraction，HS-SPME）與氣質聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術對兩種酸奶揮發性風味物質進行測定，以分析山葵酸奶風味特點與優勢，為其市場推廣提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮山葵：廣元市璽府農業開發有限公司；純牛奶：市售；低脂果膠、白砂糖：市售；直投式酸奶發酵劑：保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）：市售；開米蔬果清洗劑：天津德利豐商貿有限公司。

1.2 儀器與設備

LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海滬粵明科學儀器有限公司；LYD500W-T型均質機：上海嵐譽智能化科技有限公司；DHP-9082恒溫培養箱：天津市順諾儀器科技有限公司；TP302N電子天平：上海菁海儀器有限公司；Z15092431優普系列超純水器：四川優普超純科技有限公司；KDN-102C定氮儀：上海纖檢儀器有限公司；ZS46-350蘇泊爾榨汁機：浙江蘇泊爾股份有限公司；7890A-5975C型氣相色譜-質譜聯用儀、50/30 um DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭：安捷倫科技公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 山葵酸奶制備工藝流程

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 山葵粉的制備

選取無發黃的新鮮山葵，用流水沖洗干凈后，浸入0.2%～0.8%的開米蔬果清洗劑溶液浸泡5 min～15 min，再用無菌水沖洗干凈，用濾紙吸干山葵表面的水份后，在真空狀態下進行冷凍干燥，并用液氮粉碎機進行冷凍粉碎，將冷凍粉碎后得到的粉末過200目藥典篩，即得到山葵極細粉。

1.3.2.2 發酵劑的制備

在無菌室內取1 g直投式發酵劑干凍粉（保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌為1∶1，質量比）加入500 mL純牛奶中，混勻后，置于在42℃恒溫培養箱中發酵培養至凝固，然后貯存于4℃冰箱冷藏，制得黏稠的原味酸奶，作為試驗用發酵劑[10]。

1.3.2.3 配料均質

將白砂糖和穩定劑混合均勻按試驗設計比例加入到已預熱至80℃～85℃牛奶中，立即快速攪拌使穩定劑溶解，避免穩定劑發生聚集，當混合物溶解完全后，利用均質機在20 MPa下均質10 min[11]。

1.3.2.4 殺菌冷卻

在95℃下殺菌5 min后，需將滅菌奶冷卻至40℃～45℃，并按試驗設計比例加入山葵粉混合均勻。在添加山葵粉時，溫度過高會使山葵水解酶失活，導致無法生成異硫氰酸酯，并加快已生成異硫氰酸酯的揮發[12]。

1.3.2.5 接種發酵

按試驗設計比例接種活化后菌種，置于42℃恒溫培養箱中發酵，發酵4 h后，每隔10 min檢測一次酸度，直到酸度達到75°T時終止發酵。

1.3.2.6 冷卻后熟

發酵完成后，將酸奶迅速冷卻至10℃以下，并置于4℃下冷藏24 h，產品風味進一步形成，得到山葵酸奶成品[13]。

1.3.3 單因素試驗設計

1.3.3.1 山葵粉添加量的影響

在發酵劑接種量3.0%、白砂糖添加量7%、發酵時間6 h的條件下，考察山葵粉添加量（1%、3%、5%、7%、9%）對酸奶感官評分的影響。

1.3.3.2 白砂糖添加量的影響

在山葵粉添加量5%、發酵劑接種量3.0%、發酵時間6 h的條件下，考察白砂糖添加量（5%、6%、7%、8%、9%）對酸奶感官評分的影響。

1.3.3.3 發酵劑接種量的影響

在山葵粉添加量5%、白砂糖添加量7%、發酵時間6 h的條件下，考察發酵劑接種量（1%、2%、3%、4%、5%）對酸奶感官評分的影響。

1.3.3.4 發酵時間的影響

在山葵粉添加量5%、發酵劑接種量3.0%、白砂糖添加量 7%的條件下，考察發酵時間（4、5、6、7、8 h）對酸奶感官評分的影響。

1.3.4 響應面試驗設計

在單因素試驗研究結果的基礎上，確定試驗因素，采用Dsign Expert 8.0.6軟件，根據Box-Behnken設計原理，選擇山葵粉添加量（A）、發酵劑接種量（B）、白砂糖添加量（C）、發酵時間（D）4個因素為自變量，每個自變量的高低水平分別以-1，0，1進行編碼，其中0水平為單因素試驗得出的最佳水平。以山葵酸奶的感官評分為響應值進行響應面優化試驗，確定山葵酸奶制備的最佳工藝。具體響應面試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.3.5 指標測定

1.3.5.1 理化指標檢測

酸度檢測：采用滴定法測定山葵酸奶的酸度，參考GB 5009.239-2016《食品安全國家標準食品酸度的測定》。

蛋白質檢測：采用凱氏定氮的方法測定產品蛋白質，參考GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》。

非脂乳固體的測定：參考GB 5413.39-2010《食品安全國家標準乳和乳制品中非脂乳固體的測定》。

1.3.5.2 微生物指標檢測

按照GB 4789.18-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳與乳制品檢驗》要求測定酸奶中大腸菌群、致病菌數和乳酸菌數。

1.3.5.3 感官評定

根據GB 19302-2010《食品安全國家標準發酵乳》感官要求進行感官評價。由20名專業人員組成感官評定小組，參照表2的評定標準，分別對山葵酸奶的組織狀態（30分）、滋味（35分）、風味（20分）和乳清析出（15分）進行評分，取其平均值作為山葵酸奶感官評定最后得分。

表2 山葵酸奶感官評定標準Table 2 Sensory evaluation standard of horseradish yogurt

1.3.6 揮發性風味物質的測定

1.3.6.1 樣品前處理

分別秤取山葵酸奶和普通酸奶（未添加山葵粉）樣品5 g置于25 mL萃取品瓶，同時加入2 g NaCl及5 mL超純水，旋緊萃取瓶，充分混勻，加熱到45℃，鹽析30 min待檢。推動固相微萃取裝置手柄將老化好的萃取頭插萃取瓶中，距離樣品頁面1 cm處左右進行頂空吸附萃取，鹽析萃取40 min左右。取出完成吸附萃取的萃取頭，迅速插入氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀器進樣口，推出纖維頭，于250℃下解析5 min。進行GC-MS分析。

1.3.6.2 GC-MS條件

實驗組患者急救和疼痛緩解時間均少于對照組；研究組患者的臨床護理滿意度為97.5%，顯著高于對照組的70%，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1、表2。

1）色譜條件

色譜柱：DB-WAX石英毛細柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：常溫升至 40 ℃，保持 2.5 min，以5℃/min升至200℃，再以10℃/min升至240℃，保持5 min；進樣口溫度為250℃；傳輸線230℃，全掃描模式；載氣為氦氣，流速1.0 mL/min；不分流進樣。

2）質譜條件

EI電力源，70 eV電子能量；離子源溫度為250℃，質量掃描范圍為35 amu～400 amu；發射電流100 μA，檢測電壓1.4 kV。

1.3.6.3 定性定量方法

將試驗數據圖譜與NIST2011標準色譜數據庫進行自動檢索匹配，并參考相關文獻，對試驗結果進行確認。根據樣品保留時間進行定性，并按面積歸一法計算該物質的相對百分含量。

1.3.7 數據處理

采用 office Excel 2010和 origin 9.0、Design Expert 8.0.6進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 山葵粉添加量對酸奶感官品質的影響

山葵粉作為山葵酸奶試驗的主要原料，對山葵酸奶的滋味起決定性的作用，根據添加量的多少，山葵風味及其獨特的辛辣味所占比例將產生差異。添加量過少，則山葵風味及其獨特的辛辣味不足，甜味及酸味相對偏重；添加量過大，則山葵風味及辛辣味偏大，甜味及酸味相對不明顯。山葵粉添加量對山葵酸奶感官評分的影響見圖1。

由圖1可知當山葵粉添加量為時5%，感官評分最高，得到的產品風味醇厚，辛辣味、甜味及酸味適中，滋味協調，基質為翠綠色。因此，山葵粉的適宜添加量選為5%。

圖1 山葵粉添加量對山葵酸奶感官評分的影響Fig.1 Influence of horseradish powder addition on sensory score of horseradish yogurt

2.1.2 發酵劑接種量對酸奶感官品質的影響

發酵劑接種量對酸奶感官評分的影響見圖2。

圖2 發酵劑接種量對酸奶感官評分的影響Fig.2 Influence of the amount of starter inoculation on the sensory quality of yogurt

由圖2可知，感官評分開始時隨著發酵劑的增加而增加，當發酵劑接種量為3%時，感官評分最高，隨后感官評分隨著發酵劑的增加而降低。其原因可能是接種量過大則產酸過快，易造成凝乳中蛋白質脫水收縮現象，使乳清析出較多，導致酸奶感官品質降低。因此，發酵劑適宜接種量選為3%。

2.1.3 白砂糖添加量對酸奶感官品質的影響

白砂糖添加量對山葵酸奶感官評分的影響見圖3。

由圖3可知，酸奶感官品質隨白砂糖添加量的遞增先增加后降低，在白砂糖添加量為7%時評分最高，得到的產品酸甜協調，辛辣適宜。當添加量低于7%時，酸奶以酸味及辛辣味為主，甜味不明顯，感官品質較低；當添加量高于7%時，雖然酸味和辛辣味在一定程度上有所掩蓋，但人工矯味痕跡明顯，甜味偏重，感官品質下降。因此選擇風味最協調的7%白砂糖添加量。

2.1.4 發酵時間對酸奶感官品質的影響

發酵時間對酸奶感官評分的影響見圖4。

圖3 白砂糖添加量對山葵酸奶感官評分的影響Fig.3 Influence of sugar content on sensory score of horserpish yogurt

圖4 發酵時間對酸奶感官評分的影響Fig.4 Influence of fermentation time on sensory score of yogurt

隨著發酵時間的增加，酸奶基質越穩定，酸味越濃厚。發酵時間過少，則酸奶基質不穩定，有不同程度的乳清析出現象，并且酸味不足；發酵時間過長，酸味偏重，而凝固的酸奶基質區別不大，因此根據評分選擇最佳發酵時間為6 h。由圖4可知，發酵時間為6 h時，感官評分最高，因此選擇最佳發酵時間為6 h。

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗結果

根據單因素試驗結果選擇山葵粉添加量、發酵劑接種量、白砂糖添加量、發酵時間4個因素為自變量，以山葵酸奶的感官評分結果為響應值，設計了四因素三水平29個點的響應面分析試驗，試驗結果如表3所示。

表3 響應面試驗結果Table 3 Experimental design and results forresponse surface analysis

續表3 響應面試驗結果Continue table 3 Experimental design and results forresponse surface analysis

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析

利用Dsign Expert 8.0.6軟件進行回歸分析，對表3數據進行回歸擬合得到回歸方程Y=94.40-1.59A+3.03B-1.03C+1.99D-1.10AB+1.82AC+2.15AD-2.05BC-1.06BD+0.53CD-5.13A2-4.99B2-7.07C2-3.03D2

對表3回歸模型進行方差分析，結果見表4。

表4 響應面試驗回歸方程方差分析結果Table 4 Result of variance analysis of regression equation of response surface test

續表4 響應面試驗回歸方程方差分析結果Continue table 4 Result of variance analysis of regression equation of response surface test

由表4可知，感官評分模型顯著（p＜0.05），失擬項不顯著（p＞0.05），說明方程擬合充分，回歸方程的相關系數R2=0.986 2，R2Adj=0.972 4表明擬合度良好，說明試驗數據可以較好反應和感官評分間的關系。由p值可知，一次項中山葵粉液添加量（A）、發酵劑接種量（B）、發酵時間（D）對感官評分有極顯著影響，白砂糖添加量（C）對感官評分有顯著影響。二次項 A2、B2、C2、D2對感官評分有極顯著影響。各因素間的交互作用AC、AD、BC、BD對感官評分有顯著影響。由主要因素A、B、C、D的各F值可知，各因素對山葵酸奶的感官品質影響的順序為：發酵劑接種量（B）＞發酵時間（D）＞山葵粉液添加量（A）＞白砂糖添加量（C）。

2.2.3 響應面圖分析

通過Design-Expert分析得到山葵酸奶響應面分析圖，圖5為交互因素對響應面值的響應曲面及等高線圖。

圖5 各因素交互影響感官評分的等高線圖和響應曲面圖Fig.5 Contour plot and response surface plot of sensory score were affected by various factors

由圖5可知，山葵酸奶感官評分隨著新鮮山葵粉添加量、發酵劑接種量、白砂糖添加量、發酵時間的增加均呈現先增加后減少的關系。經軟件分析得到山葵酸奶的最佳工藝條件為：山葵粉添加量為4.82%，發酵劑接種量為3.33%，白砂糖添加量為6.86%，發酵時間為6.17 h。

2.2.4 驗證試驗

利用回歸模型預測山葵酸奶的最佳工藝條件為：山葵粉添加量為4.82%，發酵劑接種量為3.33%，白砂糖添加量為6.86%，發酵時間為6.17 h。考慮到實際情況，將最佳工藝參數調整為：山葵粉添加量為4.8%，發酵劑接種量為3.3%，白砂糖添加量為6.9%，發酵時間為6.2 h，感官評分達95.27。為驗證模型的準確性，按最佳優化工藝條件進行3次重復驗證試驗，所得酸奶產品呈現淡綠色，表面光滑，有微量乳清析出，凝乳結實，酸甜可口，有山葵特殊的辛辣味及山葵香氣，綜合評分94.78分。與模型預測值接近，說明響應面優化的山葵酸奶發酵工藝是可行的。

2.3 山葵酸奶質量評價結果

2.3.1 理化指標檢測結果

產品理化檢測結果見表5。

表5 理化指標檢測結果Table 5 Physical and chemical index test results

由表5可知，其蛋白質含量2.56 g/100 g，酸度85.0°T，脂肪 3.03 g/100 g，非脂乳固體 8.29 g/100 g。由此可見山葵酸奶理化指標均符合國標的要求，產品品質得到了保證。

2.3.2 微生物檢測結果

微生物檢測結果見表6。

表6 微生物指標檢測結果Table 6 Microbial index test results CFU/mL

由表6可知，山葵酸奶乳酸菌數為8.03×107CFU/mL，大腸桿菌、致病菌未檢出，山葵酸奶微生物指標符合國標要求。

2.4 揮發性風味物質的測定

2.4.1 總離子色譜圖

采用SPME富集酸奶中揮發性風味物質，并利用GC-MS聯用儀進行分離鑒定。得到的山葵酸奶樣品總離子流圖見圖6，普通酸奶樣品總離子流圖見圖7。

2.4.2 風味物質含量及種類分析

經過GC-MS的檢測分析，利用NIST數據庫自動匹配，并參考相關文獻，在山葵酸奶、普通酸奶中共檢測的物質如表7所示。

從表7可知，山葵酸奶和普通酸奶的揮發性風味物質主要包括醛類、酯類、醇類、酮類、酸類、烴類物質等6類。兩種酸奶風味物質的種類無明顯差別，但物質間含量有差異，各類風味物質呈味閾值差距大，使得兩種酸奶有各自獨特風味特征。

圖6 山葵酸奶總離子流圖Fig.6 Total ion flow chart of horseradish yogurt

圖7 普通酸奶總離子流圖Fig.7 Total ion flow chart of general yogurt

表7 山葵酸奶、普通酸奶揮發性風味物質種類及相對含量Table 7 Kinds and relative contents of volatile flavor substances in horseradish yogurt and ordinary yogurt

山葵酸奶共檢測到34種揮發性風味物質，包括醛類7種（17.96%）、酯類9（19.6%）、醇類2種（5.6%）、酮類3種（24.59%）、酸類7（22.72%）、烴類5（6.35%），其他1種（2.35%）；普通酸奶共檢測到29種揮發性風味物質，包括醛類7種（11.06%）、酯類7（8.83%）、醇類 2種（5.41%）、酮類1種（19.73%）、酸類5種（38.31%）、烴類6（9.8%），其他1種（3.12%）。

醛類物質是酸奶典型的重要風味成分之一，產生各種氧化風味，其風味閾值一般較低，對風味作用較大[14]。山葵酸奶較普通酸奶醛類物質高，分別為17.96%、11.06%。主要是山葵酸奶中壬醛和反-2-十二烯醛的相對百分含量高于普通酸奶，可賦予酸奶玫瑰、柑橘等香氣。

酯類化合物的產生主要是由于脂肪酸水解和微生物代謝，酯類化合物的風味閾值低，盡管相對百分含量低，但對酸奶的風味作用貢獻高[15]。山葵酸奶較普通酸奶酯類物質高，分別為19.6%、8.83%。山葵酸奶和普通酸奶中共同檢測到的酯類物質中對風味貢獻較大的是丁位十二內酯、丁位癸內酯。丁位十二內酯具有濃甜的桃子、香草味、奶油味；丁位癸內酯具有桃子、乳脂香氣。山葵酸奶含特有的3-丁烯基異硫氰酸酯、異硫氰酸稀丙酯、甲基異硫氰酸酯，可賦予酸奶特殊的辛香味。

醇類物質風味閾值較高，通常對對食品整體風味的影響不大[16]。兩種酸奶醇類物質含量差別不大，分別為5.60%、5.41%，含量較低，對風味貢獻不大。

酮類物質主要由不飽和脂肪酸的氧化、熱降解和氨基酸降解產生，對風味貢獻較大[17]。山葵酸奶較普通酸奶酮類物質高，分別為24.59%、19.73%，共有成分甲基庚基甲酮賦予酸奶果香、甜香、蠟香、皂香、青香及椰子、奶油的氣味。山葵酸奶特有成分甲基壬基甲酮、1，8-二氮雜環四癸烷-2，9-二酮可賦予酸奶出水果味、新鮮味。

酸類物質是酸奶的主要風味物質，對酸奶的滋味及氣味起到重要作用[18]。山葵酸奶和普通酸奶酸類物質含量差異較大，分別為22.72%、38.31%。造成兩種酸奶在酸類物質的差異可能是山葵中的異硫氰酸酯影響了乳酸菌的生長，從而造成山葵酸奶中酸類物質含量低于普通酸奶。酸奶兩種酸奶共同檢出的酸類物質分別是辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸，形成了酸奶的酸爽口感。其中辛酸呈水果香氣；壬酸呈淡的脂肪和椰子香氣；葵酸是脫脂乳酸奶中主要的呈味酸類，增加奶香；月桂酸在感官上表現為爽口微甜；肉豆蔻酸具有辛香味。山葵酸奶特有的己酸、棕櫚酸可賦予酸奶特殊的香味。酸奶中過高的酸奶物質會造成刺激性氣味，對比普通酸奶，山葵酸奶減少了尖酸口感，風味更佳柔和。烴類的風味閾值較高，幾乎沒有香氣，對酸奶的風味影響不大[19]。山葵酸奶烴類物質較普通酸奶低，分別為6.35%、9.80%，主要為烷烴類化合物。

3 結論

經單因素試驗及響應面優化試驗，確定山葵酸奶最佳生產工藝條件為：山葵粉添加量為4.8%，發酵劑接種量為3.3%，白砂糖添加量為6.9%，發酵時間為6.2 h，綜合感官評分94.78分，與模型預測值95.27接近。采用SPME-GC-MS技術測定山葵酸奶和普通酸奶風味物質表明，山葵酸奶醛類、酯類、醇類、酮類物質含量高于普通酸奶，而酸類、烴類物質低于普通酸奶，山葵酸奶醛類、酯類、醇類、酮類、酸類、烴類分布更加合理，酸味降低風味更加柔和，形成了山葵酸奶特有的辛香風味。