河南產(chǎn)白蒿精油的化學(xué)成分分析及抑菌活性研究

（鄭州師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，河南鄭州450044）

食品腐敗是一個(gè)全球性的問(wèn)題，數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的人遭受著由食物傳播的痛苦感染。因此，迫切需要尋找新型、有效、安全的抗菌藥物。植物精油能以接觸或熏蒸的方式在食物周圍形成抑菌氛圍而達(dá)到防腐保鮮[1-2]，是人類開(kāi)發(fā)綠色抗氧化劑和抗菌防腐劑的重要原料。蒿類植物在地球上分布廣泛，氣味濃郁，富含精油，多數(shù)具有殺菌滅蟲(chóng)之功效，在醫(yī)療、保健、食品保鮮、化妝品等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。如吳克剛等[3]研究了芳香植物精油對(duì)食品常見(jiàn)腐敗微生物抗菌活性作用，試驗(yàn)表明，腐敗微生物對(duì)植物精油表現(xiàn)出不同的敏感性；崔惠敬等[4]研究了植物精油對(duì)大菱鲆弧菌的體外和體內(nèi)抗菌活性，發(fā)現(xiàn)14種待測(cè)植物精油對(duì)大菱鲆弧菌具有不同程度的抑制效果，其中肉桂醛的抗菌活性最強(qiáng)；Zahra M等[5]研究發(fā)現(xiàn)，黃連木揮發(fā)油重要成分a-蒎烯對(duì)消化性潰瘍有一定的保護(hù)作用；段偉麗等[6]研究表明，艾蒿精油對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌均有抑制作用。白蒿（Herba artimisiae sieversianae）又稱茵陳、大籽蒿、豬毛蒿等。醫(yī)學(xué)研究表明白蒿具有清熱解毒、抗菌消炎、祛濕消腫、抗氧化、抗艾滋病等功效[7]。

本研究以河南產(chǎn)白蒿植物為原料，采用水蒸氣蒸餾法提取精油，通過(guò)傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform-infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR） 和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS） 聯(lián)用儀對(duì)精油成分進(jìn)行了分析，并就白蒿精油對(duì)大腸桿菌、四聯(lián)球菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制活性進(jìn)行了探究，旨在尋求一種綠色安全、無(wú)污染的食品防腐劑，也為白蒿中藥資源的綜合利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

TFT-1310氣相色譜-質(zhì)譜儀器：賽默飛世爾科技有限公司；FTIR-650紅外光譜儀器：津港東科技發(fā)展股份有限公司；LX-07A萬(wàn)能高速粉碎機(jī)：紅光工貿(mào)有限公司；FA116分析天平：上海?？惦娮觾x器；DHG-9076A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海景洪試驗(yàn)設(shè)備有限公司；DHP-2150電熱恒溫培養(yǎng)箱：鄭州生元儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌鍋：松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社。

白蒿原料：白蒿植物地上部分，于6月初采于河南信陽(yáng)光山，陰干保存，粉碎備用；大腸桿菌、四聯(lián)球菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌菌種：鄭州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院微生物試驗(yàn)室；乙醚、丙酮、二甲基亞砜、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉試劑均為分析純：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；瓊脂、蛋白胨、牛肉膏等：上海國(guó)藥試劑集團(tuán)；試驗(yàn)用蒸餾水均為二次蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 白蒿精油的提取

將采集的新鮮白蒿材料去桿陰干，粉碎成末，準(zhǔn)確稱量10份，每份30 g，分別放進(jìn)500 mL的圓底燒瓶里，以料液比1∶10（g/mL）的量加入蒸餾水，室溫（20℃）浸提8 h后加入1g氯化鈉，幾粒沸石，采用簡(jiǎn)易水蒸氣蒸餾裝置（燒瓶、恒壓漏斗、球形冷凝管）對(duì)白蒿精油進(jìn)行提取，每隔10 min轉(zhuǎn)移一次餾出液，直至恒壓漏斗上層無(wú)油狀物為止，約回流2 h。將餾出液轉(zhuǎn)至分液漏斗中，加入4 mL乙醚萃取3次，醚層經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后水浴加熱蒸除乙醚，即得精油，稱重。置于4℃冰箱里密封保存。

1.2.2 白蒿精油的成分分析

將提取出來(lái)白蒿精油用丙酮稀釋后，采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)精油成分進(jìn)行測(cè)定分析。色譜條件：色譜柱為ZB-5熔融石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。載氣：氦氣；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣方式：分流比 1 ∶10，進(jìn)樣量：1 μL。程序升溫柱溫：初始溫度60℃，保留3 min；以6℃/min升至260℃并保持10 min。質(zhì)譜條件：離子源為電子轟擊離子源（electron impact ion source，EI），電子能量 70 eV，離子源溫度200℃。掃描范圍：30 amu～500 amu，掃描速率0.2 scans/s。用計(jì)算機(jī)譜庫(kù)NIST進(jìn)行檢索。

采用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）對(duì)獲得的精油樣品進(jìn)行表征。檢測(cè)條件為：KBr壓片法，測(cè)定范圍4 000 cm-1～500 cm-1。

1.2.3 白蒿精油的抑菌試驗(yàn)

1.2.3.1 菌懸液的制備

培養(yǎng)基的制備：在大燒杯中加入250 mL蒸餾水、1%的蛋白胨、0.3%牛肉膏、0.5%氯化鈉，1.5%瓊脂粉，加熱攪拌均勻。將配置好的培養(yǎng)基分裝在錐形瓶中，用封口膜封好，放入高壓蒸汽滅菌鍋中在120℃下滅菌2 h。

細(xì)菌接種及擴(kuò)培：在紫外燈滅菌30 min，通風(fēng)10 min的超凈工作臺(tái)上，將培養(yǎng)基倒入無(wú)菌空白培養(yǎng)皿上，待培養(yǎng)基冷卻凝固后，用接種環(huán)將大腸桿菌、四聯(lián)球菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌菌株分別接種于上述培養(yǎng)基中，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將活化后的細(xì)菌用接種環(huán)，接種于新的培養(yǎng)液，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，使用平板計(jì)數(shù)法調(diào)整濃度為 106CFU/mL～107CFU/mL，即得菌懸液[8]，備用。

1.2.3.2 白蒿精油抑菌劑的制備

白蒿精油以體積分?jǐn)?shù)為5%的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）水溶液為溶劑，對(duì)其進(jìn)行溶解稀釋，配制濃度分別為 100、52、26、17 mg/mL 的精油抑菌劑，并設(shè)置溶劑空白對(duì)照試驗(yàn)。

1.2.3.3 抑菌性測(cè)定

采用濾紙片法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)的測(cè)定。具體操作如下：用移液槍分別吸取100 μL菌懸液到培養(yǎng)皿中，使用滅菌涂布棒將細(xì)菌涂布于培養(yǎng)基表面。用無(wú)菌鑷子，夾取浸有白蒿精油抑菌劑的3片濾紙片置于含菌平板上，每個(gè)平板有3個(gè)樣品，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，同時(shí)設(shè)置溶劑空白試驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑以評(píng)估抑菌活性大小。

1.2.3.4 最低抑菌濃度的測(cè)定

最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測(cè)定參照文獻(xiàn)[6]，采用平板法。先在試管中以5%二甲基亞砜溶劑稀釋配制一系列濃度的白蒿精油溶液，精油濃度范圍在 0.5 μL/mL～50 μL/mL，每個(gè)試管中加入50 μL上述配制的菌懸液。以體積分?jǐn)?shù)5%的二甲基亞砜為對(duì)照，37℃培養(yǎng)24 h，每管取100 μL涂布，培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況，以平板無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的精油體積分?jǐn)?shù)作為最低抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 白蒿精油的紅外光譜分析

以KBr壓片，采用FT-IR對(duì)獲得的白蒿精油樣品進(jìn)行表征，測(cè)定范圍4 000 cm-1～500 cm-1，紅外光譜如圖1所示。

圖1 白蒿精油紅外光譜Fig.1 FT-IR spectra of essential oil from Herba artimisiae Sieversianae

由圖1可知，3 421 cm-1處較強(qiáng)的吸收峰為羥基O-H的伸縮振動(dòng)，說(shuō)明白蒿精油中含有較多的醇類物質(zhì)；2 921 cm-1處為CH3和CH2的C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，1 631 cm-1處為C=C的伸縮振動(dòng)吸收，1 600 cm-1～1 450 cm-1處的多重峰為苯環(huán)骨架的特征吸收峰，提示白蒿精油中含有較多的揮發(fā)性烯烴及芳香類有機(jī)物。

2.2 白蒿精油的GC-MS分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)白蒿精油化學(xué)成分進(jìn)行了檢測(cè)，得到白蒿精油的總離子流如圖2。

圖2 白蒿精油氣相色譜-質(zhì)譜分析總離子流圖Fig.2 GC-MS total ion current chromatogram of essential oil from Herba artimisiae Sieversianae

由圖2可知，白蒿精油成分較復(fù)雜，從白蒿精油中分離出約63種組分。通過(guò)計(jì)算機(jī)NIST-MS譜庫(kù)自動(dòng)檢索各組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并對(duì)結(jié)果參考有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對(duì)和人工分析，以面積歸一化法計(jì)算出精油各組分的相對(duì)含量，其主要化學(xué)成分及含量見(jiàn)表1。

由表1和圖2可知，共鑒定出河南產(chǎn)白蒿精油中的主要化合物26種，占精油總含量的85.05%，主要成分有氧化石竹烯（15.24%）、鐮葉芹醇（14.34%）、大根香葉三烯-1-醇（8.90%）、桉油烯醇（6.61%）、棕櫚酸（5.72%）、α-畢橙茄醇（5.19%）、香橙烯氧化物（3.71%）、亞麻酸（2.64%）、藍(lán)桉醇（2.58%）等。從精油化學(xué)成分的類別上看，白蒿精油含有較多的醇類、烯烴成分，這與紅外光譜圖得出的結(jié)論一致。據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，鐮葉芹醇、大根香葉三烯-1-醇、桉油烯醇等物質(zhì)具有光譜抗菌的作用，其中鐮葉芹醇還有抗腫瘤、抗凝血、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等醫(yī)藥功效。白蒿精油的化學(xué)成分及其含量也與其它文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相差較大，劉群等[9]從長(zhǎng)春野生白蒿中提取的揮發(fā)油主要化學(xué)成分為1，8-桉葉油素、反-丁香烯、順-丁香烯和樟腦等；Suleimenov E M等[10]對(duì)采自哈薩克斯坦的白蒿精油進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其主要含有月桂烯、桉油精、芳樟醇、對(duì)傘花烴等；李海亮等[11]從其白蒿精油中共鑒定48種化合物，其中紅沒(méi)藥醇、蘭香油奧2種組分總含量占精油總量的50%以上。這些差異可能與白蒿的產(chǎn)地、氣候、生長(zhǎng)環(huán)境以及提取條件等因素有密切關(guān)系。

表1 白蒿精油化學(xué)成分含量表Table 1 Chemical composition of essential oil from Herba artimisiae Sieversianae

2.3 白蒿精油抑菌試驗(yàn)結(jié)果分析

按照1.2.3中抑菌性測(cè)定方法，以5%二甲基亞砜溶劑空白試驗(yàn)為參照，采用濾紙片法進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，以抑菌圈直徑大小評(píng)估抑菌活性。抑菌圈直徑大于20 mm時(shí)為極敏；16 mm～20 mm為高敏；11 mm～15 mm為中敏；8 mm～10 mm為低敏；小于8 mm為不敏感[12]。5%二甲基亞砜溶劑及不同濃度的白蒿精油抑菌劑對(duì)大腸桿菌、四聯(lián)球菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 白蒿精油對(duì)4種待試菌的抑菌活性Table 2 Antimicrobial activities of essential oil from Herba artimisiae Sieversianae against 4 tested microbes

由表2可知，5%二甲基亞砜溶劑對(duì)4種待測(cè)細(xì)菌的抑菌能力較弱，抑菌圈直徑基本接近7 mm，最大僅為7.5 mm。其抑菌效果見(jiàn)圖3。

圖3 二甲基亞砜溶劑抑菌效果圖Fig.3 Antibacterial activities of DMSO solvent against 4 tested microbes

二甲基亞砜溶劑對(duì)四聯(lián)球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌幾乎沒(méi)有抑菌性，對(duì)蠟樣芽孢桿菌有微弱的抑菌性，因此選取5%二甲基亞砜作為精油的溶解試劑可行。

通過(guò)對(duì)表2數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，白蒿精油對(duì)大腸桿菌、四聯(lián)球菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌4種受試菌均有較強(qiáng)的抑菌作用，同一濃度的白蒿精油抑菌液對(duì)不同的菌株抑菌能力不同。濃度為100 mg/mL的精油抗菌效果如圖4所示。

白蒿精油對(duì)枯草芽孢桿菌抗性效果最好，100mg/mL濃度的抑菌試驗(yàn)中抑菌圈直徑可達(dá)22.20 mm，對(duì)蠟樣芽孢桿菌抗性稍差，抑菌圈為15.50 mm。

不同濃度的精油抑菌液抑菌效果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，隨著精油抑菌液濃度的升高，抑菌圈直徑增大，抑菌能力增強(qiáng)，如圖5所示。

圖4 同一濃度（100 mg/mL）白蒿精油對(duì)不同細(xì)菌的抑菌效果圖Fig.4 Antimicrobial activities of essential oil with 100 mg/mL from Herba Artimisiae Sieversianae against 4 tested microbe

圖5 不同濃度的白蒿精油對(duì)四聯(lián)球菌的抑菌效果圖Fig.5 Antimicrobial activities of essential oil with different concentrations from Herba artimisiae Sieversianae against Micrococcus tetragenus

17 mg/mL濃度的白蒿精油對(duì)四聯(lián)球菌的抑菌圈直徑僅為9.00 mm，而濃度為100 mg/mL時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到20.67 mm，為前者的2.29倍。

為了進(jìn)一步了解白蒿精油對(duì)4種受試菌的抑菌效果，就白蒿精油對(duì)4種受試菌的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可發(fā)現(xiàn)，不同菌種對(duì)白蒿精油的抗性不同，最低抑菌濃度也不同。其中精油對(duì)枯草芽孢桿菌最低抑菌濃度最小，僅為2.5 μL/mL；對(duì)四聯(lián)球菌和大腸桿菌最低抑菌濃度均為5 μL/mL；對(duì)蠟樣芽孢桿菌的最低抑菌濃度為10 μL/mL?？梢?jiàn)，極少量的白蒿精油即可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，在實(shí)際應(yīng)用中可大大節(jié)省成本。

表3 白蒿精油對(duì)供試菌種的最低抑菌濃度Table 3 Minimal inhibitory concentrations of essential oils from Herba artimisiae Sieversianae against 4 tested microbes

3 總結(jié)與展望

本研究采用水蒸氣蒸餾法提取白蒿植物精油，采用紅外光譜（FT-IR）及氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)精油化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)和分析，共鑒定出河南產(chǎn)白蒿精油中的主要化合物26種，占精油總含量的85.05%，主要成分有氧化石竹烯、鐮葉芹醇、大根香葉三烯-1-醇、桉油烯醇、棕櫚酸、α-畢橙茄醇、香橙烯氧化物、亞麻酸、藍(lán)桉醇等。

通過(guò)對(duì)河南產(chǎn)白蒿精油的抑菌活性研究發(fā)現(xiàn)，精油對(duì)大腸桿菌、四聯(lián)球菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌4種受試細(xì)菌均有一定的抑制作用，其中對(duì)枯草芽孢桿菌抑制活性最強(qiáng)而對(duì)蠟樣芽孢桿菌較弱，在試驗(yàn)濃度下，對(duì)枯草芽孢桿菌最大抑菌圈直徑達(dá)到了22.20 mm，顯示了極敏性。抑菌試驗(yàn)結(jié)果提示白蒿精油含有較強(qiáng)抑菌活性的化學(xué)成分，這對(duì)于白蒿藥材的研發(fā)及天然食品防腐劑的開(kāi)發(fā)提供了理論參考。

隨著社會(huì)的高速發(fā)展以及人們對(duì)生活品質(zhì)要求的不斷提高，越來(lái)越多人的更加傾向選擇天然產(chǎn)物添加的產(chǎn)品。蒿類植物種類豐富，遍布世界各地，取材方便，價(jià)格低廉，其植物精油香氣濃郁，可作香料，又具有抗菌作用，在未來(lái)的食品、醫(yī)療領(lǐng)域?qū)⒕哂芯薮蟮膽?yīng)用前景。