低鹽青方腐乳關鍵風味物質及部分功能性研究

馬艷莉，梁靜靜，李素萍，丁玉峰，席曉麗，王頡，郭書賢

（1.河北農業大學食品科技學院，河北保定071000；2.南陽理工學院河南省工業微生物資源與發酵技術重點實驗室，河南南陽473004）

腐乳作為傳統發酵豆制品，在中國已有一千多年的食用歷史，它營養豐富、滋味鮮美，被人民群眾廣泛喜愛。但是，腐乳是含鹽量較高的食品，流行病學證據表明，高血壓等疾病的發病率與食鹽攝入量呈顯著負相關性，因此，目前食品工業向低鹽化方向發展，腐乳的高鹽含量嚴重限制產品消費，影響其功能性發揮，妨礙其向國際化市場推進。相關研究表明，當腐乳的食鹽含量從10%下降到6%后，其抗氧化性、血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性會增強，并且活性的保持能力也更強[1]。因此，降低腐乳食鹽含量勢在必行，也是目前腐乳行業迫切需要解決的問題。

腐乳生產中使用較多食鹽主要目的是抑制有害菌生長、控制酶活，而乳酸菌和丁酸梭菌有抑制有害菌生長的作用，因此可以考慮部分代替食鹽應用于腐乳生產。益生菌應用于腐乳生產，改善其生產工藝有少量報道。后酵期間各種微生物的生長代謝活動也會對腐乳品質產生重要的影響。劉會勇等[2]通過調整發酵溫度、添加酶類物質、酵母菌等來縮短腐乳生產周期，腐乳在發酵60 d時，香氣濃郁，口感細膩，各項指標均達到了國家標準要求。現代研究表明，發酵豆制品富含的多種生物活性物質獨自或協同作用，形成了發酵豆制品獨特的生理功能，如抗氧化、降血壓、抑制乙酰膽堿酯酶、降血糖、抗菌等[3]。腐乳中含有多種抗氧化成分，如大豆異黃酮、酚酸類化合物、多肽等[4]，賦予腐乳產品良好的抗氧化活性。

本文在前期研究基礎上，使用乳酸菌豆坯代替傳統鹵水豆坯接種雅致放射毛霉進行前期發酵，不經過鹽腌過程，并在后發酵湯料中添加乳酸菌LB01和丁酸梭菌BP01，直接進入后發酵過程，嘗試制作低鹽腐乳，并研究其品質特征和部分功能性變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）標準品、乙酰膽堿酯酶（acetylcholine esterase，AchE）（220 U/mg）、血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）（2 U/mg～6 U/mg）、鄰苯二甲醛（ortho-phthalaldehyde，OPA）、5，5’-二硫代-2，2’-二硝基苯甲酸 [5，5-dithiobis（2-nitrobenzoic acid），DTNB]、甲醇、鄰苯二甲酸二乙酯、甲硫醇、丁酸乙酯、乙酸乙酯、正丁醇、丙酸丁酯、丁酸、丙酸等：西格瑪奧德里奇公司；高純氦氣（純度≥99.999%）：北京千禧京城氣體有限公司；β-巰基乙醇：北京鼎國生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

氣相色譜-質譜聯用儀（Agilent7890A-5975C）：美國安捷倫公司；96孔酶標板（MS-8496F）：Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.；酶標儀（Model 680）：日本伯樂生命醫學公司；中草藥粉碎機（FW135）：天津市泰斯特儀器有限公司；高效液相色譜儀（LC-10A）：日本島津公司；真空冷凍干燥機（EYELA FDU-540）：Tokyo Rikakikai Co.，Ltd.；紫外-分光光度計（UV mini 1240）：Shimadzu Co.；臺式離心機（TDL-40B）：上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

樣品制備方法同前期研究中的樣品制備方法[5]。

1.3.1.1 腐乳對照樣品的制備

通過噴灑雅致放射毛霉孢子懸浮液于鹵水豆坯上制得毛坯，然后腌制5 d（食鹽含量達11%～14%），將腌制好的12塊鹽坯放入玻璃瓶中，加入140 mL后酵湯料，在28℃左右后酵45 d，即可制得腐乳對照樣品。

1.3.1.2 低鹽樣品1的制備

通過噴灑雅致放射毛霉孢子懸浮液于乳酸菌豆坯上制得毛坯，然后不經腌制將毛坯直接放入玻璃瓶中，加入140 mL后酵湯料，在28℃左右后酵45 d，即可制得低鹽樣品1。

1.3.1.3 低鹽樣品2的制備

通過噴灑雅致放射毛霉孢子懸浮液于乳酸菌豆坯上制得毛坯，然后不經腌制將毛坯直接放入玻璃瓶中，加入140 mL后酵湯料，加入濃度為1×106CFU/mL的乳酸菌和丁酸梭菌菌懸液各5 mL，在28℃左右后酵45 d，即可制得低鹽樣品2。

1.3.2 關鍵揮發性風味物質含量測定

采用動態頂空法萃取樣品揮發性風味物質，氣質聯用法 （gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）對萃取的成分進行鑒定，再通過動態頂空稀釋法（dynamic headspace dilution analysis，DHDA）結合嗅聞檢測技術對關鍵揮發性成分進行分析確定，參考馬艷莉等[6]方法。

1.3.3 γ-氨基丁酸（GABA）含量測定方法

使用高效液相色譜法 （high performance liquid chromatography，HPLC）法測定樣品中GABA含量，參考Pyo等[7]的方法，略有改動。

1.3.3.1 樣品提取液制備

稱取0.50 g凍干粉樣品于離心管中，加入5.0 mL質量分數為10%的三氯乙酸，渦旋振蕩1 min，然后在40℃水浴中振蕩提取2 h，10 000 r/min離心15 min，上清液經0.45 μm濾膜過濾，得到樣品提取液備用。

1.3.3.2 樣品柱前衍生

將鄰苯二甲醛（OPA）10 mg，β-巰基乙醇 20 μL 溶于2.5 mL乙腈中，得到OPA衍生試劑。吸取0.4 mol/L硼酸緩沖液（pH 10.4）400 μL，OPA 衍生試劑 80 μL，樣品提取液80 μL，混合均勻后室溫（25℃左右）反應5 min，衍生后取20 μL進HPLC檢測。

1.3.3.3 HPLC檢測條件

C18 色譜柱：4.6 mm×150 mm×5 μm；流動相：20%乙腈的醋酸鈉緩沖液；流速：0.8 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：40℃。

1.3.4 丁酸含量測定方法

使用HPLC法測定樣品中丁酸含量，參考Zhang等[8]的方法，略有改動。

1.3.4.1 樣品提取液制備

稱取樣品凍干粉0.50 g于50 mL離心管中，加入40 mL蒸餾水，超聲振蕩30 min，8 000 r/min離心20 min，取上清液，過0.45 μm濾膜制得樣品提取液。

1.3.4.2 HPLC檢測條件

色譜柱：Shimadzu SCR-101（H）7.9 mm×300 mm；流動相：5 mmol/L的硫酸水溶液；柱溫：40℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm。

1.3.5 乙酰膽堿酯酶（AchE）抑制活性測定方法

采用Ellman光度檢測法測定樣品AchE抑制活性，參照Ellman等[9]的方法，略有修改。

1.3.5.1 樣品提取液制備

稱取樣品凍干粉0.50 g，加入5 mL 80%乙醇溶液，16 000 r/min均質1 min，超聲提取20 min，常溫（25℃左右）振蕩提取1 h，沸水浴15 min，4 000 r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm濾膜，得到樣品提取液備用。

1.3.5.2 AchE抑制活性測定方法

在96孔酶標板中加入150 μL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 8.04），30 μL 不同稀釋濃度的樣品提取液，陰性和陽性對照中以30 μL磷酸鹽緩沖液代替，然后加入 50 μL DTNB （756 μmol/L），20 μL 稀釋后的AchE酶液（0.54 U/mL），陰性對照不加酶液，以磷酸鹽緩沖液代替，微孔板振蕩器上混合均勻后，置于37℃培養箱中保溫5 min，取出后在所有微孔中加入50 μL底物（3 mmol/L），振蕩混合均勻，用酶標儀測定樣品動力學速率。酶標儀設為動力學測定模式，檢測波長405 nm，連續讀數10次，每次測定間隔28 s，振蕩3 s，抑制率的計算公式為：

抑制率/%=（K陽性對照-K樣品）/（K陽性對照-K陰性對照）×100

1.3.6 血管緊張素轉換酶（ACE）抑制活性測定方法

ACE抑制活性測定參考Li等[10]的方法，略有改進。

1.3.6.1 樣品提取液制備

稱取0.50 g樣品凍干粉于離心管中，加入5.0 mL蒸餾水，振蕩混勻。15 000 r/min均質2 min，超聲提取5 min，再于室溫（25℃左右）下搖床振蕩提取1 h。將上述樣液沸水浴15 min，5 000 r/min離心10 min，上清液過0.45 μm濾膜，得到樣品提取液備用，其濃度標記為100 mg/mL。

1.3.6.2 ACE抑制活性測定方法

將樣品提取液適當稀釋，在96孔酶標板上將20 μL樣液（無抑制的反應液中以蒸餾水代替）與40 μL 4.66 mmol/L的底物溶液混合，然后加入40 μL 12.5 mU/mL的酶液（對照液中以蒸餾水代替），在微孔板混合器上混勻后置于37℃恒溫箱中反應1 h，然后加入150 μL 1.2 mol/L NaOH溶液終止酶反應。接著在反應液中加入40 μL 2%的OPA溶液，混合均勻，室溫（25℃左右）下靜置20 min后加入40 μL 6 mol/L的HCl溶液終止衍生反應。將上述溶液適當稀釋后，在30 min～90 min內測定熒光吸收強度，條件如下：激發波長340 nm；發射波長455 nm；狹縫寬度5 nm。樣液的ACE抑制活性計算公式如下：

式中：a為抑制劑與ACE都存在時對熒光的吸收強度；b為抑制劑不存在，而ACE存在時對熒光的吸收強度；c為抑制劑存在而ACE不存在時的熒光吸收強度；d為抑制劑與ACE都不存在時的熒光吸收強度。

ACE抑制率越大，說明抑制劑在該濃度條件下抑制ACE活性的能力越強。以抑制劑濃度的對數值為橫坐標，以抑制率為縱坐標，繪制回歸曲線，計算抑制率達到50%時抑制劑的濃度，即為半抑制濃度，記為IC50。IC50值越小，代表抑制劑對ACE活性抑制能力越強。

1.3.7 多肽含量測定方法

樣品多肽含量測定參照Church等[11]的方法。

1.3.8 數據處理方法

采用SPSS 16.0軟件對所得數據進行方差分析，顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 低鹽腐乳關鍵揮發性風味物質相對含量研究

使用GC-MS法對低鹽腐乳風味物質進行測定，對照前期研究基礎[12]鑒定的青方腐乳關鍵揮發性風味物質，發現大多數關鍵性風味物質在低鹽腐乳中被檢測到，所以進一步使用內標物2-甲基3-庚酮對低鹽腐乳關鍵揮發性風味物質進行相對定量，其相對含量如表1所示。

表1 低鹽腐乳關鍵揮發性風味物質相對含量Table 1 Relative content of key flavor compounds in low-salt sufu μg/g

與對照樣品相比，低鹽樣品中部分關鍵風味物質相對含量降低，特別是低鹽樣品1降低更明顯，可能導致低鹽樣品1特征性風味有所改變。低鹽樣品2中一些風味物質相對含量也有所降低，特別是吲哚相對含量降低明顯，與對照和低鹽樣品1有顯著性差異。吲哚是一種亞胺類物質，高濃度時有強烈的臭味，并對人體產生一定危害，某些有害菌，如大腸埃希菌、變形桿菌、霍亂弧菌等能分解色氨酸生成吲哚。低鹽樣品2中吲哚相對含量降低可能與其后發酵湯料中添加益生菌有關，乳酸桿菌和丁酸梭菌可能會抑制致病菌及腐敗菌的生長繁殖，進而抑制這些有害菌代謝產物產生，進而降低了吲哚等胺類物質的相對含量。

2.2 低鹽腐乳GABA含量和丁酸含量研究

對低鹽樣品GABA含量研究結果如圖1所示。

圖1 低鹽腐乳GABA含量Fig.1 GABA content of low-salt sufu

低鹽樣品GABA含量分別達188.92 mg/100 g干重和223.95 mg/100 g干重，為對照樣品的1.33倍和1.57倍，由此可見，低鹽發酵提高了樣品的GABA含量，推測原因有以下幾方面：首先，低鹽腐乳樣品使用乳酸菌發酵豆坯制作，乳酸菌發酵提高食品GABA含量已有大量報道[13-14]。因此，由于乳酸菌的作用，低鹽腐乳豆坯中GABA含量可能已高于對照中的鹵水豆坯。其次，本研究中低鹽腐乳生產不經歷鹽腌過程，有利于GABA的合成，并且在一定程度上會減少GABA隨坯體中水分流失而減少。在兩種低鹽樣品中，后發酵添加乳酸菌和丁酸梭菌的低鹽樣品2中GABA含量明顯高于未添加的樣品1，進一步說明了乳酸菌對GABA合成具有促進作用。對低鹽腐乳丁酸含量測定結果如圖2所示。

圖2 低鹽腐乳丁酸含量Fig.2 Butyrate content of low-salt sufu

低鹽樣品1丁酸含量與對照沒有顯著性差異（P＞0.05），而低鹽樣品2丁酸含量大約比對照增加了39.46%，表明腐乳后酵湯料中添加丁酸梭菌可以提高丁酸含量。

2.3 低鹽腐乳乙酰膽堿酯酶抑制活性研究

阿爾茲海默癥患者大腦內的神經遞質-乙酰膽堿的缺失是引起該疾病的關鍵因素，乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AchE）可以催化乙酰膽堿發生裂解反應，引起乙酰膽堿缺失，因此，抑制AchE活性可以預防阿爾茲海默癥的發生[15]。發酵豆制品作為發酵食品的重要組成部分，其AchE抑制活性也被關注，Liu等[16]調查了19種市售豆豉樣品，發現其不同程度地存在AchE抑制活性。前期試驗證實青方腐乳具有乙酰膽堿酯酶（AchE）抑制活性，且其活性高于所測定的其他類型腐乳，本研究對益生菌發酵生產的低鹽腐乳AchE抑制活性進行測定，結果如圖3所示，益生菌發酵低鹽樣品具有AchE抑制活性，但是與對照無顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 低鹽腐乳乙酰膽堿酯酶抑制活性Fig.3 Acetylcholinesterase inhibitory activity of low-salt sufu

2.4 低鹽腐乳血管緊張素轉換酶抑制活性和多肽含量

血管緊張素轉換酶（angiotensinconverting enzyme，ACE）可以催化無活性的血管緊張素Ⅰ轉化為刺激血管收縮、引起血壓升高的血管緊張素Ⅱ。ACE抑制劑可以抑制ACE活性，從而減少血管緊張素Ⅱ的形成，達到防治高血壓的目的[17]。研究表明，腐乳具有ACE抑制活性[18]，目前，腐乳ACE抑制活性被認為由多肽引起，這些ACE抑制肽能抑制ACE活性，防止血管平滑肌收縮，起到降壓作用，并且不會引起正常血壓降低。對低鹽腐乳血管緊張素轉換酶（ACE）抑制活性和多肽含量進行研究，結果如圖4所示。

低鹽腐乳ACE抑制活性和多肽含量均顯著高于對照（P＜0.05），其中低鹽樣品2具有最高ACE抑制活性，后發酵45 d時，其ACE抑制活性達84.66%，同時，其多肽含量也高于對照和低鹽樣品1。在前期對使用傳統方法生產的青方腐乳發酵過程中ACE抑制活性和多肽含量進行研究時發現，降低食鹽含量并控制發酵時間有助于ACE抑制活性和多肽含量增加，本研究中生產的低鹽腐乳降低了食鹽含量并把發酵時間控制在45 d。所以，其ACE抑制活性和多肽含量增加可能與該生產工藝改進相關。此外，本研究中低鹽腐乳2生產過程去除鹽腌過程，且后發酵添加益生菌，這些工藝的改進均有可能促進ACE抑制活性的提高。

圖4 低鹽腐乳血管緊張素轉換酶抑制活性和多肽含量Fig.4 Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity and peptide content of low-salt sufu

3 結論

后發酵湯料中添加益生菌會抑制致病菌及腐敗菌的生長繁殖，一定程度上提高青方腐乳的食用安全性和功能性。后酵湯料添加益生菌發酵可降低吲哚相對含量等胺類物質的相對含量，明顯提高低鹽腐乳樣品中GABA和丁酸含量，低鹽樣品GABA含量為對照樣品的1.33倍和1.57倍，丁酸含量大約比對照增加了39.46%，益生菌發酵低鹽腐乳具有乙酰膽堿酯酶抑制活性，但是與對照無顯著差異（P＜0.05），其血管緊張素轉換酶抑制活性和多肽含量與對照相比有顯著提高（P＜0.05），說明益生菌低鹽發酵對不同功能性的影響存在差異。