檸檬醛猴樟莖段組織培養技術研究

肖祖飛 王玲玲 曹璐瑤 廖文軒 金志農* 李 鳳

呂雄偉1 張北紅1 趙 姣1

(1.南昌工程學院江西省樟樹繁育與開發利用工程研究中心，南昌 330099； 2.江西省科學院生物資源研究所，南昌 330096)

檸檬醛猴樟(Cinnamomumbodinierivar.citralifera)是指枝葉精油主成分主含檸檬醛的猴樟，屬樟科樟屬植物，特產我國，分布于云南、四川、湖北、湖南、貴州等省，尤以貴州分布最廣[1]。檸檬醛猴樟樹形優美、冠大陰濃，材質堅實、有光澤、有香味，枝葉可提取精油，是重要的園林綠化、用材、油用樹種。目前，對其的研究有形態解剖學[2]、生態學特性[3]、栽培與繁育[4]、造林技術[5]、抗逆性[6]、精油的提取與化學成分分析[7]等方面，除抗寒性研究較多外，其他方面研究均較少，關于猴樟組織培養研究未見報道。本文以檸檬醛猴樟一年生半木質化枝條為材料，研究采集季節、消毒時間和激素對檸檬醛猴樟莖段組織培養的影響，同時探索檸檬醛猴樟生根組培苗的煉苗、移栽技術，旨在為檸檬醛猴樟的無性繁殖提供理論依據，為更好開發與利用檸檬醛猴樟提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料來自南昌工程學院樟樹種質資源圃的5年生檸檬醛猴樟。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料采集時間對檸檬醛猴樟莖段培養的影響

分別于2017年5月中旬、7月中旬和9月中旬采集生長健壯的一年生半木質化枝條，剪取帶1～2個芽的莖段(1.5～3.0 cm)，沖洗2 h，置于超凈工作臺，75%酒精的浸泡30 s，用無菌水沖洗3～5次，用0.1%的升汞(HgCl2)消毒5 min，接種在MS+1.2 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1IBA培養基，每瓶1個莖段，30瓶，3次生物重復。接種30 d，統計污染率、褐化率和腋芽萌芽率。

1.2.2 消毒時間對檸檬醛猴樟莖段培養的影響

于2017年5月中旬,選取生長健壯半木質化枝條，剪取帶1～2個芽的莖段(1.5～3.0 cm)，沖洗2 h，置于超凈工作臺，75%酒精的浸泡30 s，用無菌水沖洗3～5次，用0.1%的升汞進行消毒，消毒時間分別為3、5、7和9 min，用無菌水沖洗3～5次，莖段放在無菌濾紙上吸干表面水分，接種在MS+1.2 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1IBA培養基，每瓶1個莖段，30瓶，3次生物重復。接種30 d，統計污染率、褐化率和腋芽萌芽率。

1.2.3 激素濃度對檸檬醛猴樟莖段萌芽誘導培養的影響

于2017年5月中旬,選取生長健壯半木質化枝條，剪取帶1～2個芽的莖段(1.5～3.0 cm)，沖洗2 h，置于超凈工作臺，75%酒精的浸泡30 s，用無菌水沖洗3～5次，用0.1%的升汞進行消毒5 min，用無菌水沖洗3～5次，莖段放在無菌濾紙上吸干表面水分，接種在MS培養基，添加6-BA(0.25、0.50、1.00、2.00 mg·L-1)，IBA(0.05、0.10、0.20、0.40 mg·L-1)。每個處理30瓶，每瓶1個莖段。接種30 d，統計腋芽萌芽率。

1.2.4 激素濃度對檸檬醛猴樟增殖培養的影響

挑選生長健壯、葉片舒展光亮、株高3～5 cm的無菌苗，修剪成莖段，莖段至少帶有一葉一芽(1.5 cm)，接種在MS培養基，添加6-BA(0.50、1.00、1.50、2.00 mg·L-1)，IBA(0.05、0.10、0.15、0.20 mg·L-1)。每個處理20瓶，每瓶7～8個莖段。繼代培養30 d，統計增殖芽數、苗高、莖粗。

1.2.5 檸檬醛猴樟生根誘導培養研究

挑選生長健壯、葉片舒展光亮、株高3～5 cm的無菌苗接種于1/2MS培養基，添加IBA(0.50、1.00、1.50、2.00 mg·L-1)，每瓶7～10株。生根培養25 d統計生根率、根數、根粗和根長。

1.2.6 檸檬醛猴樟生根苗煉苗和移栽技術研究

生根培養20～22 d，將組培生根苗移至透光25%～30%，溫度25～30℃的大棚內煉苗7～10 d。用自來水清洗干凈生根苗根部培養基，置于帶有少量清水的托盤。移栽前將生根苗用0.5%多菌靈粉劑進行消毒30 min，之后移入裝滿基質的無紡布袋中央，用噴壺澆透水。之后保持基質濕潤，見干即澆，每次澆透。移栽2個月后統計成活率。

1.3 數據統計與分析

株高、根長用米尺測量、地徑、根粗用游標卡尺測定。采用Excel2010軟件進行數據的錄入、整理和方差分析。

污染率(%)=(污染的外植體數/接種的外植體數)×100

(1)

褐化率(%)=(褐化的外植體數/接種的外植體數)×100

(2)

萌芽率(%)=(萌芽的外植體數/接種的外植體數)×100

(3)

增殖系數=新增殖芽數/原接入芽數

(4)

生根率(%)=(生根苗數/接入株數)×100

(5)

2 結果與分析

2.1 材料采集時間對檸檬醛猴樟莖段培養的影響

由表1可知，不同時間采集材料對檸檬醛猴樟莖段初代培養有顯著影響，隨采集時間的延后，污染率和褐化率顯著提高，萌芽率顯著降低。5月中旬，外植體污染率最低，為17.78%，顯著低于7月中旬(28.89%)和9月中旬(41.11%)，褐化率也是最低，為11.11%，與7月中旬差異不顯著，顯著低于9月中旬(21.11%)，5月中旬萌芽率最高，高達56.67%，顯著高于7月中旬和9月中旬，9月中旬萌芽率最低，為25.56%。

表1 材料采集時間對檸檬醛猴樟莖段培養的影響

Table 1 Effects of material collection time on stem segment culture ofC.bodinierivar.citralifera

采集時間Collection time污染率Pollution rate(%)褐化率Browning rate(%)萌芽率Germination rate(%)5月中旬Mid-May17.78±2.43c11.11±1.89b56.67±4.12a7月中旬Mid-July28.89±1.67b13.33±1.51b40.00±2.65b9月中旬Mid-September41.11±3.18a21.11±1.20a25.56±1.67c

注：表中同一列數據后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Notes:Different normal letters in the same column indicate significant differences among treatments atP<0.05.The same as below.

2.2 消毒時間對檸檬醛猴樟莖段培養的影響

由表2可知，隨著消毒時間的增加，檸檬醛猴樟莖段組織培養污染率逐漸降低，褐化率逐漸升高，萌芽率先升高后下降。檸檬醛猴樟莖段消毒3 min，污染率高達65.56%，顯著高于其他處理，消毒5和7 min污染率在15%～20%，二者差異不顯著，顯著高于消毒9 min，消毒9 min污染率最低，為8.89%。檸檬醛猴樟莖段消毒9 min褐化率最高，為56.67%，顯著高于其他處理，其次是消毒7 min，褐化率為24.44%，消毒5和3 min，褐化率較低，分別為12.22%和5.56%。消毒5 min，萌芽率最高，為57.78%，顯著高于其他消毒時間，其次是消毒7 min，萌芽率最低的是消毒3 min。因此，5月份采集檸檬醛猴樟半木質化枝條，修剪成1～2芽莖段，0.1%升汞消毒5 min，進行初代培養，萌芽率最高，污染率和褐化率較低。

2.3 激素濃度對檸檬醛猴樟莖段萌芽誘導培養的影響

由表3可知，檸檬醛猴樟萌芽率隨6-BA濃度的增加而升高，隨IBA濃度的增加而降低，當6-BA濃度為1.0 mg·L-1、IBA濃度為0.05 mg·L-1時，檸檬醛猴樟萌芽率達到最高60.00%，其次是2.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1IBA，萌芽率最低的是1.0 mg·L-16-BA+0.4 mg·L-1IBA，萌芽率為16.67%。因此，誘導檸檬醛猴樟莖段萌芽最適培養基為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1IBA。

表2 消毒時間對檸檬醛猴樟莖段培養的影響

Tabel 2 Effect of disinfection time on stem segment culture ofC.bodinierivar.citralifera

消毒時間Disinfection time(min)污染率Pollution rate(%)褐化率Browning rate(%)萌芽率Germination rate(%)365.56±3.42a5.56±0.37d10.00±1.67c518.89±1.85b12.22±1.03c57.78±2.59a716.67±1.40b24.44±3.16b35.56±2.26b98.89±1.17c56.67±3.95a16.67±1.73c

表3 激素配比對檸檬醛猴樟莖段萌芽誘導培養的影響

Tabel 3 Effects of hormone ratio on stem segment germination induction culture ofC.bodinierivar.citralifera

處理Treatment接種莖段Number of stem segment culture萌芽莖段Number of stem segment germination萌芽率Germination ratioMS+0.25mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IBA30723.33MS+0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IBA301136.67MS+1.0mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IBA301860.00MS+2.0mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IBA301653.33MS+1.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1IBA301240.00MS+1.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1IBA30826.67MS+1.0mg·L-16-BA+0.4mg·L-1IBA30516.67

2.4 激素濃度對檸檬醛猴樟增殖培養的影響

由表4可知，在IBA濃度不變的情況下，隨著6-BA濃度的增加，檸檬醛猴樟莖段的增殖系數先升高后稍降低的趨勢。處理2，檸檬醛猴樟莖段增殖系數最高，為4.33，顯著高于處理1，與處理3和處理4差異不顯著。在6-BA濃度不變，檸檬醛猴樟莖段的增殖系數隨著IBA濃度的增加呈現先基本不變，當濃度達到0.2 mg·L-1，增殖系數顯著增加，顯著高于其他處理。株高較大的是處理7(3.98 cm)、處理6(3.81 cm)和處理3(3.72 cm)，其次是處理1、處理2和處理5，最差的是處理4(3.40 cm)。各處理地徑生長差異不顯著。因此，檸檬醛猴樟最適增殖培養基為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA。

2.5 IBA對檸檬醛猴樟組培苗生根的影響

2.5.1 檸檬醛猴樟組培苗生根過程基部形態變化

檸檬醛猴樟組培苗生根培養1～5 d，基部形態基本沒有變化；培養7 d時，少部分組培苗基部膨大，有少量愈傷；培養11 d時，部分組培苗不定根突破表皮，不定根出現；培養14 d時，組培苗不定根進行生長，不定根明顯(圖1)，之后不定根增長、增粗生長。

表4 激素配比對檸檬醛猴樟增殖培養的影響

Tabel 4 Effects of hormone ratio on proliferation culture ofC.bodinierivar.citralifera

處理Treatment激素配比Hormone ratio(mg·L-1)6-BAIBA增殖系數Multiplication株高Plant height(cm)地徑Ground diameter(cm)處理1Treatment 10.50.201.83±0.47c3.46±0.32cd1.14±0.11a處理2Treatment 21.00.204.33±0.73a3.67±0.17bcd1.04±0.05a處理3Treatment 31.50.204.08±0.61a3.72±0.06abc1.08±0.09a處理4Treatment 42.00.204.00±0.45a3.40±0.14d1.28±0.27a處理5Treatment 51.00.052.33±0.16b3.62±0.21bcd0.90±0.05a處理6Treatment 61.00.102.33±0.25b3.81±0.09ab1.15±0.18a處理7Treatment 71.00.152.00±0.08bc3.98±0.13a1.06±0.04a

圖1 1.5 mg·L-1 IBA誘導檸檬醛猴樟組培苗生根過程Fig.1 Induction of rooting process of tissue culture seedlings of C.bodinieri var. citralifera by 1.5 mg·L-1 IBA

2.5.2 IBA對檸檬醛猴樟組培苗生根的影響

由表5可知，IBA對檸檬醛猴樟組培苗生根有顯著促進作用。隨著IBA濃度的增加，生根率先升高后降低，1.5 mg·L-1IBA處理，生根率達到75%，顯著高于其他處理，其次是2.0mg·L-1IBA處理(68.75%)，生根率最低的是0.5 mg·L-1IBA處理。1.5 mg·L-1IBA處理，根數最多，達到3.5，其次是2.0 mg·L-1IBA處理(3.06)，0.5 mg·L-1IBA處理，根數較少，為2.40。根長和根粗各處理差異不顯著。因此，檸檬醛猴樟最適生根培養基為1/2MS+1.5 mg·L-1IBA。

2.6 檸檬醛猴樟生根苗的移栽和苗期管理

生根培養20～22 d，將組培生根苗移至透光25%～30%，溫度25～30℃的大棚內煉苗7～10 d。之后用醫用鑷子將生根苗取出，用自來水清洗干凈生根苗根部培養基，置于帶有少量清水的托盤。移栽前將生根苗放入40%多菌靈粉劑0.5%溶液中消毒5～10 min，用醫用鑷子小心將生根苗移入裝滿基質的無紡布袋中央，稍微壓實基質，以防苗木基部松動，隨即用噴壺澆透水。之后保持基質濕潤，見干即澆，每次要澆透。根數大于3，移栽成活率可達80%以上，苗木木質化后可將苗移入大田定植(圖2)。

表5 IBA對檸檬醛猴樟生根的影響

Tabel 5 Effect of IBA on rooting ofC.bodinierivar.citralifera

處理Treatment生根率Rooting rate(%)根數Number of root根長Root length(cm)根粗Root diameter(cm)1/2MS+0.5mg·L-1IBA31.15±3.83d2.40±0.21c4.79±09.47a0.74±0.08a1/2MS+1.0mg·L-1IBA40.00±3.15c2.63±0.16bc5.32±0.95a0.69±0.12a1/2MS+1.5mg·L-1IBA75.00±2.27a3.50±0.18a5.06±0.82a0.82±0.10a1/2MS+2.0mg·L-1IBA68.75±5.06b3.06±0.33ab5.28±0.64a0.71±0.07a

圖2 檸檬醛猴樟組培苗定植Fig.2 Planting of tissue culture seedlings of C.bodinieri var. citralifera

3 討論

組織培養具有操作簡單、繁殖系數高、脫毒、可周年生產等優點，可以在短期內獲得大規模苗木，滿足市場需求，是木本植物快速、高效無性繁殖的主要方式。目前，關于猴樟的組織培養研究未見報道，而同屬植物樟樹的組織培養研究較多。

基本培養基是影響組織培養成功的關鍵，木本植物組織培養常用基本培養基有MS、DCR、B5、WPM等培養基，其中樟樹組織培養采用較多的基本培養基是MS[8～9]，也有研究表明B5培養基比MS培養基更適合樟樹愈傷組織的生長[10]，DCR基本培養基較適合樟樹芽的培養[11]。本試驗中檸檬醛猴樟莖段的誘導萌芽和增殖采用MS基本培養基，生根培養采用1/2MS培養基，獲得較好的效果，關于其他基本培養基是否適合檸檬醛猴樟的組織培養有待進一步研究。

取材時間不同，外植體發育狀況不同，生理狀態不同，影響植物組織培養成功。外植體消毒時間太短，外植體消毒不干凈，污染率高；消毒時間太長，污染率低，但對外植體殺傷力大，褐化嚴重。有研究表明一年中1～4月份采集香樟外植體接種，感菌率低，無菌活體獲得率超過50%[12]。也有研究表明，香樟4～6月取材，感菌率最高，8月前后，感菌率最低[13]。本研究結果表明，5月中旬采集檸檬醛猴樟半木質化枝條，修剪成一葉一芽莖段，0.1%升汞消毒5 min，莖段腋芽萌芽率最高，褐化率和污染率較低。這可能與枝條木質化程度和枝條在環境中暴露時間有關，5月中旬，半木質化枝條生長旺盛，腋芽處于活動狀態，細胞容易誘導，而且枝條與外界環境接觸不久，表面灰塵、細菌較少。

外源激素是植物組織培養成功的關鍵因子，在外植體的誘導、不定芽的分化與增殖及芽苗生根培養過程中，外源激素發揮重要的作用。長期以來，對激素的研究一直停留在憑經驗摸索的基礎上，對于同一植物，所用激素種類和濃度說法不一。BA、NAA和IBA是植物組織培養中應用最廣的激素。有研究表明6-BA對香樟芽的增殖影響較大，與低濃度的IBA配合使用有利于芽的增殖，采用MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA培養基進行芽的增殖，增殖系數最高，達到6.1。芽苗接入1/2MS+0.2 mg·L-1IBA培養5 d，之后轉入1/2MS無激素培養基培養，生根率最高，達到93.6%，并且生根數大于3、最長根大于2 cm的苗超過80%[14]。MS培養基中加入Ca(NO3)2適合香樟初代培養，究其原因可能是：一方面可以提供苗木更多的Ca2+，同時NO3有利于K+、Mg2+、Ca2+等陽離子的吸收，另一方面可以避免初代的褐化。6-BA和IAA配合使用，香樟叢生芽分化正常，生長健壯，叢生芽誘導適宜培養基為MS2(MS+Ca(NO3)2)+4～5 mg·L-16-BA+2 mg·L-1IAA，繼代增殖培養基為MS2+3～3.5 mg·L-16-BA+2 mg·L-1IAA，生根培養基為MS2+3.0 mg·L-1IBA+1.5 mg·L-1IAA+50～100 mg·L-1氯化膽堿，生根率為85%[15]。也有研究表明GA3對芳樟不定芽的增殖有一定影響，芳樟在MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA+0.2 mg·L-1GA3培養基上，月增殖系數能夠達到15[16]。本研究結果表明，檸檬醛猴樟莖段萌芽最適培養基為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1IBA，萌芽率為60%。檸檬醛猴樟增殖適宜培養基為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA，增殖系數為4.33，適宜生根培養基為1/2MS+1.5 mg·L-1IBA，生根率為75%。