城市常見落葉的纖維素高效降解菌種分離

高 樂,惠 璠,郭雅妮,姜 潔

(1.陜西省現代建筑設計研究院,陜西 西安 710048;2.西安工程大學 環境與化學工程學院,陜西 西安 710048)

0 引 言

城市綠化廢棄物屬于可再生能源,具備良好的經濟利用價值,處理得當可解決綠化廢棄物的消納問題,一舉兩得[1]。目前針對城市綠化廢棄物處理的主要途徑有焚燒、填埋、堆肥。焚燒產生的大量污染物會造成二次污染,且無法有效利用燃燒產生的熱量[2];填埋對于綠化廢棄物的處理效果非常有限,不僅占用寶貴的土地資源,且循環周期較長[3];相比而言,城市綠化廢棄物的堆肥化處理具備經濟、安全的特性,是綠化廢棄物資源化利用的重要途徑[4]。

落葉是綠化廢棄物的主要組成部分,通過微生物降解轉化為腐殖質或有機營養物,最終得到腐熟的堆肥產品[5],可作為土壤改良劑、有機肥和栽培基質，完成資源化利用[6]。微生物在城市綠化廢棄物堆肥處理中起著至關重要的作用[7],但由于落葉中纖維素含量較高且難降解,導致其堆肥周期一般較長,使大規模進行落葉堆肥處理受到限制[8]。因此,為提高以落葉為主的綠化廢棄物堆肥效率、堆肥質量,加快堆肥腐熟，縮短堆肥周期就顯得非常必要。而目前的研究僅停留在降解效果的測定和直接利用商業菌種堆肥,鮮有分離有效促進纖維素降解的優勢菌為目的的研究[9-10]。

本文以中國北方城市最常見落葉(懸鈴木落葉、小葉女貞落葉)為原料,以易得的污水廠剩余污泥、土壤、豬糞、雞糞等不同菌劑對落葉進行微生物降解,特別針對其中難降解的纖維素類物質進行降解,以期通過分離獲得利于堆肥化處理的纖維素高效降解菌種,為縮短綠化廢棄物堆肥周期提供基礎支持。

1 實 驗

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料 以中國北方城市常見落葉—懸鈴木落葉、小葉女貞落葉為材料(取自西安市市區)。將原材料按要求進行烘干、粉碎(粒徑約5 mm，用于降解實驗)，研磨、過60目篩，用于各指標測定。

豬糞、雞糞(取自西安市臨潼區某養殖場); 剩余污泥(取自西安市某污水處理站);土壤(取自西安工程大學臨潼校區花園)；商品菌劑為液體農富康種植菌液;泔水(取自西安工程大學臨潼校區食堂)。

1.1.2 試劑 蛋白胨、酵母膏、羧甲基纖維素鈉、瓊脂為生化試劑,其余試劑均為分析純試劑。

1.1.3 儀器 多功能粉碎機(9F-330型,河南省滎陽市永興機器廠);恒溫水浴振蕩槽(DKZ-2型,杭州匯爾儀器設備有限公司);高壓蒸汽滅菌鍋(YX280B型,上海三申醫療器械有限公司);控溫消煮爐(KXL1010型,北京京晶科技有限公司);生化培養箱(SPX-250B型,上海市醫療器械批發部);電熱恒溫干燥箱(DHG-9247A,上海精宏實驗設備有限公司);冷凍離心機(Centrifuge 5810R,EPPENDORF公司);紫外分光光度計(V-1100,上海美譜達儀器有限公司);電子天平(ESJ120-4,沈陽龍騰電子有限公司);凝膠電泳儀(DYY-6C 型,北京六一儀器廠);PCR 儀(TP600型,日本 Takara公司)。

1.2 方法

1.2.1 原料組分測定 1) 含水率的測定:采用稱重法測定樣品含水率。

2) 總有機碳的測定[11]:

C=[0.003(V0-V)CFe/m]×100%

式中:C為樣品有機碳質量百分比;V0為空白樣滴定消耗的FeSO4體積(mL);V為樣品滴定消耗的FeSO4體積(mL);CFe為FeSO4溶液濃度(mol·L-1);m為落葉樣品的質量(g);0.003為1/4碳原子的毫摩爾質量(g·mmol-1)。

3) 總氮的測定:稱取烘干過篩備用的落葉樣品0.500 0 g,用凱氏定氮法在分光光度計210 nm波長處,以無氨水作參比,進行總氮的測定[12]。

4) 纖維素的測定[13]:精確稱取烘干過篩備用的樣品(18±0.001) g,加入100 mL酸性洗滌劑,煮沸1 h后坩堝過濾,經300 mL熱水(90 ℃)反復洗滌,再用丙酮洗滌2～3次,直至濾液呈無色為止;置于烘箱105 ℃烘5 h,冷卻后稱重。

1.2.2 落葉降解實驗 將落葉根據實驗要求自然風干,粉碎機破碎至前期實驗確定的最佳粒徑5 mm左右[14];取約100 g烘干粉碎的落葉放入500 mL錐形瓶稱重,加入粒徑6～8 mm的級配碎石以防結塊,碎石經過自來水浸洗3次,按照落葉的30%加入。

單組分菌劑分別為土壤、污泥、豬糞、雞糞、購買菌液,雙組分菌劑分別為土壤+污泥、土壤+豬糞、土壤+雞糞、土壤+菌液、污泥+豬糞、污泥+雞糞、污泥+菌液、豬糞+雞糞、豬糞+菌液、雞糞+菌液。物料與菌劑的添加比例為3∶1(質量比),雙組份菌劑按照1∶1(質量比)混合,同時設置一組空白對照。將以上物料混勻,利用稀釋的泔水調節含水率至50%～60%,具體表現為用手抓起物料,指縫有水滲出,但水不滴落為宜。按照降解物料的1%添加尿素,錐形瓶稱重后將樣品置恒溫振蕩培養箱(50 ℃)進行好氧降解實驗,每隔72 h取樣一次,共取樣5次。實驗開始后,前3天每隔4 h人工攪拌;其余均在每天早、中、晚固定時間段攪拌以保證物料的供氧和防止物料結塊。

1.2.3 纖維素分解菌的分離 以降解效果最佳的菌劑與落葉混合降解15 d的產物為菌種來源。在無菌超凈工作臺上稱取樣品1.0 g,稀釋法制備10-2～10-6倍的稀釋液[15]。

吸取不同梯度稀釋液100 μL,加入纖維素分解菌選擇培養基中,涂布法進行細菌和真菌分離培養,每個梯度稀釋液平行涂布平板3個。將細菌置于30 ℃恒溫培養箱中培養24～48 h,觀察不同梯度平板中菌落數量及分布情況。挑選菌落分布較均勻的平板,根據不同的菌落形態特征,分別挑取單個菌落,劃線接種于新的纖維素分解菌選擇培養基上。將純化2～3次后的菌株接種于纖維素分解菌選擇培養基中,放入培養振蕩器(轉速200 r/min、溫度25 ℃)中震蕩培養12～24 h。真菌平板于30 ℃倒置培養72 h,觀察不同梯度平板中菌落數量及分布情況,篩選出優勢數量菌落并且分布均勻的梯度平板。根據不同菌落形態特征,分別挑取單菌落接種到新的纖維素剛果紅培養基上純化2～3次,將純化后的菌株于30 ℃培養72 h后置于4 ℃冷藏保存。

利用剛果紅染色法,根據菌落透明圈出現早晚和大小初步判斷菌株產酶情況[16],菌落透明圈數量越多,面積越大,表示該菌種對纖維素的降解效果越好。

1.2.4 纖維素分解菌的鑒定 鑒定方法見文獻[17-18]。提取真菌基因組DNA,并以其為模板，選用文獻[19]真菌rDNA ITS基因克降引物,擴增菌株的基因序列。反應體系:H2O 17.8 μL,Buffer 3 μL,d NTP 2 μL,Primer1 3 μL,Primer2 3 μL,DNA 模板1 μL,酶0.2 μL;總體積30 μL。反應條件:① 95 ℃， 5 min。② 95 ℃，30 s；55℃，30 s；72 ℃，1 min；35 cycles。③ 72 ℃，10min。④ 12℃，forever。

利用ITS 通用引物對菌株進行PCR擴增,對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測[20]。

將含有真菌菌株的PCR產物送至上海天昊生物科技完成后續的菌株測序[21]。

在GenBank上對以上步驟檢測的序列進行Blast比對,獲得同源性序列,再利用MEGA 5.0 軟件構建系統發育樹[22]。

2 結果與分析

2.1 落葉混合物成分測定

表1為落葉混合物的成分表。由表1可知,落葉混合物作為降解底物，其C/N為38.35,纖維素含量較高,為48.4%。

表 1 落葉混合物的成分測定Tab.1 The composition determination of fallen leaves mixture

2.2 單組份菌劑對落葉的降解

2.2.1 總有機碳的降解 單組份菌劑降解落葉混合物過程中總有機碳的變化見圖1。由圖1可以看出,落葉混合物中的總有機碳含量整體呈下降趨勢,且發酵前期變化迅速,后期變化逐漸緩慢。分析認為發酵初期微生物活動較后期更為活躍,因此表現出發酵前期總有機碳的含量下降迅速。以落葉為原料的發酵中總有機碳的含量均很高,在發酵第15天時,雞糞發酵組的總有機碳利用率最高,總有機碳質量分數降至24.81%,其次為商品菌劑發酵組,可降至24.95%。

圖 1 單組份菌劑降解落葉過程中總有機碳的變化Fig.1 The change of TOC during fallen leaves degrading by single inoculants

2.2.2 總氮的降解 單組份菌劑降解落葉混合物過程中總氮的變化見圖2。由圖2可以看出,在發酵原料情況相同,加入不同微生物菌劑后處理的總氮含量出現差異。隨著降解時間的延長,總氮含量整體呈現緩慢增加趨勢,其中添加剩余污泥菌劑的堆肥,在第15天時總氮含量最高,達到1.72%,其余處理的發酵物中總氮含量有較小差異。所有處理的最終物料中總氮含量均高于原料,是因為降解引起總體積和質量的下降,導致后期總氮含量的上升。

圖 2 單組份菌劑降解落葉過程中總氮的變化Fig.2 The change of TN during fallen leaves degrading by single inoculants

2.2.3 C/N的變化 C/N是檢驗原料腐熟度的一個重要指標,C/N從最初的高于35～40降低到18～20。一般認為其數值達到20以下就達到腐熟,即穩定的程度,此時發酵的碳氮比趨向于微生物菌體的碳氮比。單組份菌劑降解落葉混合物過程中碳氮比的變化見圖3。由圖3可以看出,降解過程中,C/N總體呈現下降趨勢,且變化幅度較大。第9天左右雞糞對原料的降解就可達到20以下,表示處于腐熟狀態,其余的菌劑在降解時間延長至第12天之后,可以降至C/N小于20。

2.2.4 纖維素的降解 單組份菌劑降解落葉混合物過程中纖維素含量的變化見圖4。可以看出,隨著降解時間的增加,纖維素的含量整體呈現下降趨勢,在第15 d時雞糞發酵組的纖維素含量最低,降至33.1%(降解率可達31.6%),其次為土壤降解組,可降至33.6%。

圖 4 單組份菌劑降解落葉混合物過程中纖維素含量的變化

Fig.4 The change of cellulose content during fallen

leaves degrading by single inoculants

綜上結果表明,單菌劑實驗中,添加雞糞菌劑的降解效果最佳。原因是雞糞中含有豐富的蛋白質,蛋白質含量較高時,其中所含的氮元素含量也較其他菌劑高,使其發酵初始的C/N比較低,較低的C/N比有利于原料中纖維素的降解。

2.3 雙組份菌劑降解過程中各成分測定

2.3.1 總有機碳的降解 雙組份菌劑降解落葉混合物過程中總有機碳的變化見圖5。可以看出,落葉中的總有機碳含量整體呈下降趨勢,且發酵前期變化迅速,后期變化逐漸緩慢。分析認為發酵初期微生物活動較后期更為活躍,因此表現出發酵前期總有機碳的含量迅速下降。在發酵第15天時,雞糞+菌液降解組的總有機碳利用率最高,含量降至24.88%,其次為土壤+雞糞降解組,總有機碳含量降至26.53%。

圖 5 雙組份菌劑降解落葉過程中總有機碳的變化Fig.5 The change of TOC during fallen leaves degrading by double inoculants

2.3.2 總氮的降解 雙組份菌劑降解落葉混合物過程中總氮的變化見圖6。可以看出, 原料中在加入不同微生物菌劑后,不同降解處理中總氮含量出現差異。隨著降解時間延長,其中總氮含量整體呈現緩慢增加趨勢,添加剩余污泥+土壤菌劑的降解組,在第15天時總氮含量最高,達到 1.64%。所有處理的最終物料總氮含量均高于原料,是由于降解使總體積和質量均有下降,導致后期總氮含量的上升。

圖 6 雙組份菌劑降解落葉混合物過程中總氮的變化Fig.6 The change of TN during fallen leaves degrading by double inoculants

2.3.3 C/N的變化 雙組份菌劑降解落葉混合物過程中C/N的變化見圖7。可以看出,降解過程中,C/N總體呈現下降趨勢,且變化幅度較大。第9天左右,雞糞+土壤降解組對原料C/N的降解就可達到20以下,表示處于腐熟狀態,其余的菌劑在降解時間延長至12 d之后,可以降至C/N均小于20。

2.3.4 纖維素的降解 雙組份菌劑降解落葉混合物過程中纖維素含量的變化見圖8。可以看出,隨著降解時間的延長,纖維素的含量整體呈現下降趨勢,在第15天時雞糞+土壤降解組的纖維素含量降至33.4%(降解率31.0%),其次為污泥+雞糞降解組的纖維素含量,可降至33.8%,均低于加入單組份雞糞菌劑的降解效果,說明加入雙組分菌劑不利于纖維素的降解,因為菌種過多,相互之間對營養物或環境條件會存在競爭抑制作用[23]。

圖 8 雙組份菌劑降解落葉過程中纖維素的變化Fig.8 The change of cellulose content during fallen leaves degrading by double inoculants

綜上所述,雙組份菌劑實驗中添加雞糞+土壤組菌劑的物質降解效果總體最佳。原因是雞糞中含有豐富的蛋白質,蛋白質含量較高時,其中所含的總氮量也較其他菌劑高,使其降解初始的C/N較低,較低的C/N有利于原料中纖維素的降解;同時土壤中富含降解落葉的菌種,對于纖維素的降解效果較污泥、豬糞更佳;但比較而言,由于菌種之間競爭抑制的緣故,單組分菌劑雞糞對纖維素的降解效果反而更加有效。

2.4 優勢菌落的分離和觀察

選取不同菌劑與落葉混合降解15 d的產物為菌種來源,利用剛果紅選擇培養基在30 ℃恒溫培養箱中進行培養。通過觀察不同稀釋梯度平板中的微生物菌落,發現10-6倍稀釋梯度平板中的微生物數量及種類分布較為均勻,菌落獨立不重疊。因此,真菌和細菌的分離從10-6倍的稀釋梯度平板中挑選并進行分離培養。培養結果如圖9所示。

(a) 豬糞 (b) 土壤

(c) 剩余污泥 (d) 雞糞圖 9 不同菌劑中纖維素降解菌的培養

Fig.9 Culture of cellulose degrading microorganisms in different microbial inoculants

觀察菌落是否產生透明圈及其大小。透明圈數量越多,面積越大則表示該菌種對纖維素的降解效果越好。從圖9可以看出,雞糞降解組的菌種形成的透明圈個數最多最明顯,說明雞糞菌種中纖維素降解菌對纖維素的降解效果最好。

2.5 菌株的分子生物學鑒定

從前期實驗結果可知,無論是單一菌劑,還是雙組分菌劑,都表明雞糞中含有的纖維素降解菌是比較有效的。因此,通過對雞糞中分離出來的纖維素降解菌純化培養,并進行分子生物學鑒定,了解落葉中纖維素的高效降解菌種所屬,為纖維素高效降解菌種的選擇和擴大培養提供目標,以期為綠化廢棄物堆肥提供優勢微生物菌種。

2.5.1 菌株 PCR 擴增產物結果 圖10為菌株的ITS區PCR擴增產物電泳圖。圖中M為DL5000 DNA Marker; 1,2為菌株PCR產物；3，4為陰性對照。圖中顯示陰性對照組無條帶,而目的菌株的電泳條帶在500～750 bp之間,與目的條帶大小一致。表明菌株的ITS區擴增正確,可進行測序。

圖 10 菌株的ITS區PCR擴增產物電泳圖Fig.10 Electrophoresis of PCR amplified products in ITS region of strain

2.5.2 菌株的序列分析 經PCR擴增測序得到長度為530 bp的核苷酸序列,提交Blast,與NCBIGenBank數據庫中已發表的核苷酸序列進行同源性比較,結果表明相似性可達到99%以上,再運用MEGA5.0軟件包選用鄰接法(neighbor-joining method)構建系統發育樹[22],確定該菌株為橘青霉屬(penicilliumcitrinum)。

橘青霉具有易培養和生長快的優勢,可借助菌絲的生長作用大面積插入堆體,利用分泌的胞外水解酶如纖維素酶,對纖維素等有機物進行降解。在綠化廢棄物堆肥過程中,可借助添加纖維素高效降解菌縮短堆肥周期,提高堆肥效率。因此,橘青霉是一種有重要應用潛力的纖維素分解菌。

3 結論

1) 單組份雞糞菌劑降解實驗、雙組份菌劑降解實驗和菌落透明圈實驗結果均顯示雞糞菌種中纖維素降解菌對纖維素的降解效果最佳。

2) 以雞糞菌劑與落葉混合降解15 d的產物為菌種來源,篩選和分離出纖維素高效降解菌種,菌種鑒定結果為橘青霉屬(penicilliumcitrinum),具有作為高效堆肥菌的可行性和價值。