Apelin-13對急性心肌梗死家兔的治療作用

張彥宏 張波 李顯東

【摘要】 目的 探討Apelin-13對急性心肌梗死（AMI）家兔的治療作用。方法 30只雄性家兔， 隨機分為假手術組、AMI對照組和Apelin組， 各10只。術后開始給藥， Apelin組耳緣靜脈注射Apelin-130.1 mg/（kg·d）， 連續7 d， AMI對照組及假手術組注射等量生理鹽水。比較三組家兔血管內皮生長因子（VEGF）、梗死邊緣區微血管計數、凋亡指數（AI）、心臟重量/體重， 觀察三組心肌損傷程度及膠原沉積情況。結果 假手術組VEGF含量、梗死邊緣區微血管計數、AI、心臟重量/體重分別為（44.94±2.76）ng/L、（7.820±1.059）個、（42.84±2.65）%、（1.90±0.12）‰， 顯著低于AMI對照組的（59.72±

4.17）ng/L、（13.540±1.704）個、（73.97±5.03）%、（2.70±0.01）‰， 差異均有統計學意義（P<0.05）。Apelin組VEGF含量、梗死邊緣區微血管計數分別為（68.65±4.91）ng/L、（16.130±2.220）個， 均高于AMI對照組， AI及心臟重量/體重分別為（65.73±4.42）%、（2.60±0.15）‰， 均低于AMI對照組， 差異均有統計學意義（P<0.05）。HE染色可見假手術組家兔心肌組織結構排列整齊， AMI對照組可見心肌組織中有廣泛的炎性細胞浸潤， 心肌纖維斷裂， 排列紊亂， 心肌細胞壞死。Apelin-13組可見炎性細胞浸潤、心肌纖維斷裂比AMI對照組減輕。結論 Apelin-13可促進AMI家兔梗死周圍新生血管生成、側支循環形成， 縮小心肌梗死面積， 且可有效抑制心肌細胞凋亡、減輕心肌細胞損傷、改善AMI家兔心肌重構。

【關鍵詞】 Apelin-13;急性心肌梗死;心肌細胞凋亡;心肌重構

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.07.085

Effect of Apelin-13 on the treatment of acute myocardial infarction in rabbits ? ZHANG Yan-hong， ZHANG Bo， LI Xian-dong. Department of Emergency Medicine， Jilin Provincial Peoples Hospital， Changchun 130021， China

【Abstract】 Objective ? To discuss the therapeutic effect of apelin-13 on acute myocardial infarction （AMI） in rabbits. Methods ? A total of 30 male rabbits were randomly divided into sham operation group， AMI control group and Apelin group， with 10 rabbits in each group. After operation， Apelin-130.1 mg/（kg·d） was injected into the ear margin of Apelin group for 7 d. The same amount of normal saline was injected into the control group and sham operation group. The vascular endothelial growth factor （VEGF）， microvessel count in infarcted margin， apoptotic index （AI）， heart weight / body weight were compared in three groups of rabbits， and the degree of myocardial injury and collagen deposition of three groups were observed. Results ? The VEGF content， microvessel count in infarcted margin， AI and heart weight / body weight were （44.94±2.76） ng/L， （7.820±1.059） pieces，

（42.84±2.65）% and （1.90±0.12）‰ in sham operation group， which were significantly lower than （59.72±

4.17） ng/L， （13.540±1.704） pieces， （73.97±5.03）% and （2.70±0.01）‰ in AMI control group， and their difference was statistically significant （P<0.05）. The VEGF content and microvessel count in infarcted margin were （68.65±4.91） ng/L and （16.130±2.220） pieces in Apelin group， which were higher than those in the control group， and AI and heart weight / body weight were （65.73±4.42）% and （2.60±0.15）‰ respectively， which were lower than those in the AMI control group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. HE staining showed that the myocardial tissue structure of the sham operation group was neatly arranged; AMI control group showed extensive inflammatory cell infiltration， myocardial fiber rupture， disordered arrangement， and myocardial cell necrosis; Apelin-13 group showed inflammatory cell infiltration， and myocardial fiber rupture is reduced compared with AMI control group. Conclusion ? Apelin-13 can promote neovascularization and collateral circulation formation around AMI rabbit infarction， reduce the area of myocardial infarction， and can effectively inhibit myocardial cell apoptosis， reduce myocardial cell damage， and improve myocardial remodeling.

【Key words】 Apelin-13; Acute myocardial infarction; Cardiomyocyte apoptosis; Myocardial remodeling

AMI是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的主要分型之一， 極易引起心力衰竭， 嚴重威脅人類健康。Apelin是從牛胃分泌物中提取出的一種新的血管活性肽， 具有許多重要的生物學作用[1]。Apelin-13 作為 Apelin 亞型之一， 具有很強的生物活性。大量的實驗研究證實Apelin-13具有增強心肌收縮力、降壓、減輕心臟負荷、減少心肌損傷、調節水鹽代謝及體液平衡等多種心血管保護作用[2， 3]， 本實驗旨在研究Apelin-13對AMI家兔的治療作用， 從而為AMI的診治提供新的治療方法。具體研究結果報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 選取雄性家兔30只（吉林大學動物實驗中心提供）， 體重2.0～3.0 kg， 將其隨機分為假手術組、AMI對照組、Apelin組， 每組10只。

1. 2 方法

1. 2. 1 AMI模型制備[3] 開胸結扎家兔左冠狀動脈前降支， 冠狀動脈結扎成功與否依靠心電圖ST段抬高， 局部心肌變暗紅， 節段性運動不良確認， 假手術組只開胸剪破心包而不結扎冠狀動脈。

1. 2. 2 給藥方法 術后開始給藥， Apelin組耳緣靜脈注射Apelin-13（長春寶信生物制品公司提供）0.1 mg/（kg·d），

連續7 d， AMI對照組及假手術組注射等量生理鹽水。

1. 2. 3 標本采集 術后2周采耳緣靜脈血5 ml， 以10%氯化鉀耳緣靜脈注射處死動物， 摘取心臟。

1. 3 觀察指標

1. 3. 1 血清VEGF 采用酶聯免疫吸附法測定， 按試劑盒操作。

1. 3. 2 梗死邊緣區微血管計數 在左室乳頭肌橫切面處切取心肌組織， 經甲醛固定、常規脫水后再經石蠟包埋， 切成組織切片。將組織切片進行免疫組化染色， 計算梗死邊緣區微血管數量， 免疫組化步驟按試劑盒說明書操作。不是必須出現血管腔以及紅細胞， 凡染成棕色的單個內皮細胞及內皮細胞叢都被看作一個微血管。具體計數方法：低倍鏡下找到梗死邊緣區組織， 切換為200倍鏡后觀察并計算微血管數， 每張切片觀察5個視野區， 取均數為最后計數。

1. 3. 3 心肌細胞凋亡檢測 自結扎線下0.5 cm處取心肌組織， 將心肌組織置入10%多聚甲醛中， 固定24 h

后行常規石蠟包埋、切片， 貼附于表面涂有多聚賴氨酸的載玻片上。檢測心肌細胞凋亡采用Tunel法， 按照試劑盒的說明書進行操作。光鏡下觀察細胞核中呈棕黃色顆粒染色為凋亡細胞。每張切片隨機選取5個視野（×400）， 算出凋亡細胞和正常細胞的數量， 得出AI。AI=視野中凋亡細胞數量/視野中細胞總數量×

100%。

1. 3. 4 稱取心臟重量， 計算心臟重量/體重。

1. 3. 5 心臟組織病理學觀察 取左心室心肌甲醛固定， 石蠟包埋， 行光鏡分析， 觀察心肌損傷程度及膠原沉積。

1. 4 統計學方法 采用SPSS24.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 三組血清VEGF含量、梗死邊緣區微血管計數、AI及心臟重量/體重比較 假手術組VEGF含量、梗死邊緣區微血管計數、AI、心臟重量/體重低于AMI對照組， 差異均有統計學意義（P<0.05）。Apelin組VEGF含量、梗死邊緣區微血管計數均高于AMI對照組， AI及心臟重量/體重均低于AMI對照組， 差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2. 2 心肌損傷程度 HE染色可見假手術組家兔心肌組織結構排列整齊（見圖1）。AMI對照組可見心肌組織中有廣泛的炎性細胞浸潤， 心肌纖維斷裂， 排列紊亂， 心肌細胞壞死（見圖2）。Apelin-13組可見炎性細胞浸潤、心肌纖維斷裂比AMI對照組減輕（見圖3）。

2. 3 膠原沉積 經特殊染色（Masson染色）， 假手術組心肌細胞周圍可見少量藍色的膠原成分（見圖4）。AMI對照組可見大量增粗的膠原纖維沉積在血管及間質（見圖5）。Apelin-13組與AMI對照組相比， 膠原沉積顯著減少（見圖6）。

3 討論

VEGF可以促進血管內皮細胞生長、誘導血管形成， 從而促進血管新生、側支循環的形成及心肌細胞再生， 因此可對AMI患者發揮重要的心臟保護作用[4]， 血管新生可促進缺血周圍組織側支循環的建立， 良好的側支循環可減少心肌缺血和心肌梗死范圍、保護冬眠心肌及頓抑心肌、改善心功能。早期促進心肌梗死邊緣區新生血管形成， 能改善AMI后心臟功能， 改善疾病預后。本研究顯示， Apelin-13可明顯增加AMI后VEGF及梗死邊緣區微血管數， 表明Apelin-13可促進AMI家兔梗死周圍新生血管生成、減少梗死面積， 盡早形成側支循環。

心肌重構是由于心肌細胞及間質進行性改變引起的心臟重量、體積及形狀結構的變化， AMI后愈合和心肌纖維化是同時進行的動態過程， 心肌纖維化是心肌正常組織中成纖維細胞聚集、活化、增生及細胞外基質代謝紊亂、膠原過度沉積的病理生理過程， 是AMI后心力衰竭的重要原因。AMI后心室內壓力改變及內分泌和旁分泌的調節作用， 都會導致非梗死區域結締組織增生， 引起非梗死區反應性纖維化， 反應性纖維化會改變心室順應性、增加心室壁僵硬度， 從而影響心功能。而且， 這種間質纖維化還會干擾心臟正常的電傳導從而誘發心律失常的發生[5， 6]。本研究顯示Apelin-13可降低AMI家兔心臟重量/體重， 減少心肌膠原沉積。有實驗證實細胞核轉錄因子-κB（NF-κB）參與實驗小鼠早期血管炎癥反應及繼發冠狀動脈中層的增厚[7]。Apelin-13可減輕心肌纖維化， 其機制可能與阻礙血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（AngⅡ）誘導的膠原蛋白生成、降低轉化生長因子β1（TGF-β1）及結締組織生長因子的活性、抑制NF-κB表達有關。還有研究證明給予Apelin-13可改善AMI 大鼠血流動力學， 有效抑制腦鈉肽， 調節基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）/組織抑制因子-1（TIMP-1）平衡， 從而抑制心肌纖維化， 保護心肌 [7]。

心肌細胞凋亡是發生心肌重構及細胞功能紊亂的另一個重要原因， 有研究顯示， 當心肌梗死時， AMI動物模型及人均表現心肌細胞凋亡增加， 促凋亡相關基因Bax、Bak、凋亡蛋白（caspase-3）上調、抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白下調[8]。因此提出抑制細胞凋亡可能是阻止心肌梗死的有效方法[9]。本研究結果顯示， Apelin-13可明顯抑制心肌細胞凋亡， 其機制考慮為通過PI3K/Akt信號系統使Bax、Bak升高 、caspase-3表達降低， Bcl-2 表達升高所致[10]。還有研究顯示Apelin-13可減輕氧化應激和心肌炎癥反應， 對心肌細胞凋亡有改善作用[11]。

綜上所述， Apelin-13可促進AMI家兔梗死周圍新生血管生成、盡早形成側支循環、有效抑制心肌細胞凋亡、減輕心肌細胞損傷、改善心肌重構、減少梗死面積， 可為急性心肌梗死的診治提供新的治療方法。

參考文獻

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[收稿日期：2019-10-16]