青春期DEHP暴露對成年大鼠神經行為的影響

楊 媛，周鑫蓓，劉宛書，金會艷

(昆明醫科大學 基礎醫學院，云南 昆明 650500)

鄰苯二甲酸二乙基己酯(Di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP) 是目前用量較大的鄰苯二甲酸酯類化合物(PAE)的重要成員，主要應用于各種塑料產品如纖維素樹脂、聚乙烯和聚氯乙烯食品包裝材料，醫用材料和兒童玩具的生產加工[1]。由于在塑膜加工過程中，DEHP并未與PVC塑膜以共價化學鍵結合，因此，隨著時間的推移，它很容易從塑料中轉移至外環境，從而污染空氣、水體、以及土壤[1]。由于其產量巨大并且可以通過進食、飲水、呼吸以及皮膚接觸進入人體，因此，目前其生理學毒性備受全球環境醫學研究者關注[2]。

DEHP是一種公認的環境內分泌干擾物質，具有擬雌激素、抗雄激素活性的性質，可干擾人體內源性激素的分泌，因而對人和動物產生多方面不利影響，其中研究廣泛是其生殖發育毒性[3]。近年來的研究顯示暴露在DEHP環境中對神經系統也有一定的毒害作用。DEHP暴露引起神經管畸形、露腦畸形和通過芳香化酶影響神經系統的功能[4]。雖然DEHP對于動物認知行為的影響已經被人們初步認識，但是對其研究多集中于妊娠期和圍產期DEHP暴露對子鼠認知行為的影響[5]，而青春期DEHP暴露對大鼠神經行為的影響的研究較少,且研究結果也不一致。王冬的研究發現，青春前期暴露于DEHP的雄性大鼠產生焦慮樣和抑郁樣行為[6]。DEHP暴露還可損傷青春期雄鼠的空間學習記憶能力[4]。因此，本實驗探討了青春期暴露于不同劑量DEHP對成年大鼠神經行為的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

出生后21 d的SD雄性大鼠，24只，由昆明醫科大學實驗動物學部提供。整個實驗過程中動物自由進食進水，室內溫度 23～25℃，相對濕度60%～70%，維持12 h光照/12 h黑暗的晝夜節律，實驗符合相關倫理學要求。

1.2 儀器

動物行為學視頻跟蹤系統(Smart 3.0，西班牙)，紅外視頻恐懼系統(MED associates，美國)。

1.3 實驗方法

幼鼠隨機分為3組：溶劑對照組(玉米油)，中濃度組(50 mg/kg)，高濃度組(500 mg/kg)，每組各8只。連續2周對幼鼠進行灌胃處理，達到8周齡后進行行為學測試。

1.3.1 開放場實驗

行為學實驗前，提前將大鼠放入實驗室中適應2 h。開放場尺寸為40 cm×40 cm×35 cm(長×寬×高)的箱子，讓大鼠在箱內自由運動6 min，分析后5 min內的自發活動。

1.3.2 高架十字迷宮實驗

實驗時將大鼠頭朝開臂放入迷宮中央區，同時開啟攝像記錄下大鼠5 min內進入開臂次數及進入開臂的時間。

1.3.3 強迫游泳測試

大鼠放入透明玻璃圓缸中，溫度控制在25℃。第一天將大鼠放入水中訓練15 min，拿出大鼠用毛巾擦干后放回鼠籠。第二天同樣的條件下游泳6 min，記錄6 min中內后5 min大鼠不動的時間。判斷不動是指大鼠基本不做主動的活動，僅在必要的時候用后肢碰觸底面避免窒息。

1.3.4 背景條件恐懼實驗

實驗在特定的操作箱內進行(MED associates,St,Albans,VT)。第一天進行背景條件化恐懼記憶的訓練，將大鼠放在操作箱內，讓其自由探索2 min，然后給與5 次足部電擊，電擊間隔時間為2 min，每次電擊的強度為0.8 mA，持續時間為2 s。最后一次電擊結束后2 min將大鼠拿回飼養籠。記錄訓練過程中大鼠每次電擊后2 min內的僵立時間，判定標準為除了呼吸和緩慢的鐘擺式動作其他所有動作停止并持續2 s以上。24 h后，進行背景條件恐懼記憶的提取，大鼠放回恐懼訓練箱中，不給足部電擊，記錄大鼠在4 min內的僵立時間。

1.4 統計學方法

實驗結果以均值±標準誤(Mean±SEM)表示。恐懼記憶測試的數據用重復測量雙因素方差分析(repeated measure two-way ANOVA)進行檢驗。其余數據用Student's T-test 進行檢驗，統計分析采用SPSS 19，當P<0.05 認為有顯著差異。

2 結果

2.1 青春期DEHP暴露對成年大鼠焦慮樣行為的影響

首先在開放場中測試動物在新穎環境中的探索和活動性。如圖1所示,青春期DEHP暴露，中濃度組(50 mg/kg)和高濃度組(500 mg/kg)在開放場中的總的活動距離(Distance moved)與對照組相比有所增加，但無顯著性差異(P >0.05)，表明青春期DEHP暴露對成年大鼠的活動性沒有明顯影響。

(均值±標準誤，*P < 0.05，與正常對照組比較)

如圖2所示，在高架十字迷宮測試中，青春期DEHP暴露，中濃度組(50 mg/kg)和高濃度組(500 mg/kg)大鼠在開臂的時間(Time spent in open arms)和開臂的總次數(Entries in open arms)與正常對照組相比，差異均無顯著性(P>0.05)。

(均值±標準誤，*P < 0.05，與正常對照組比較)

圖2 青春期DEHP暴露對高架十字迷宮實驗的影響

2.2 青春期DEHP暴露對大鼠強迫游泳實驗的影響

(均值±標準誤，*P < 0.05，與正常對照組比較)

如圖3所示，青春期 DEHP暴露中濃度組(50 mg/kg)與正常對照組比較強迫游泳不動時間(Immobility time)有所縮短，但無顯著性差異(P>0.05)。高濃度組(500 mg/kg)與正常對照組比較強迫游泳不動時間縮短，有顯著差異(P <0.05)。表明青春期DEHP暴露影響成年大鼠在強迫游泳實驗中的活動性。

2.3 青春期DEHP暴露對大鼠背景條件恐懼實驗的影響

如圖4所示，青春期DEHP暴露，中濃度組(50 mg/kg)和高濃度組(500 mg/kg)及正常對照組都表現出較好的習得背景環境依賴的恐懼，隨著訓練的進行表現出不斷增強的恐懼行為，但沒有明顯的組間效應(P >0.05)，說明DEHP暴露和正常對照組相比，背景條件化恐懼記憶的學習沒有差異。

(均值±標準誤，*P < 0.05，與正常對照組比較)

圖4 青春期DEHP暴露對大鼠恐懼記憶的影響

第二天提取，DEHP暴露中濃度組(50 mg/kg)與正常對照組比較僵立時間(Freezing %)無明顯變化(P>0.05)，但高濃度組(500 mg/kg)與正常對照組比較僵立時間縮短(P <0.05)。表明青春期DEHP暴露影響成年大鼠在背景條件恐懼記憶的提取。

3 討論

青春期是腦發育和動物神經行為形成的又一個關鍵時期，此時腦內的性激素水平對行為性別分化起關鍵作用。因此，在此時期極易受到內分泌干擾物DEHP的影響。目前對青春期DEHP暴露對大鼠神經行為的影響的研究較少，且研究結果也不一致。本研究通過幾種行為學實驗檢測了青春期DEHP暴露對成年大鼠多種行為的影響，發現DEHP暴露不影響大鼠的活動性和焦慮樣行為，但高濃度DEHP暴露影響大鼠在強迫游泳中的活動性。同時高濃度DEHP暴露損傷了大鼠背景條件恐懼記憶。