海洋石油降解菌Pseudoalteromon SI-JHS發酵條件的優化

張愛君，程鵬高，唐 娜*，曹軍瑞

(1.天津科技大學 化工與材料學院，天津 300457；2.自然資源部天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192；3.天津市鹵水化工與資源生態化利用重點實驗室，天津 300457)

隨著我國經濟的迅猛發展，對能源特別是石油的需求量日益增長，但石油在開采、煉制、運輸和儲存過程中發生的海上溢油事故時有發生，加劇著石油對海洋環境的威脅[1-2]。目前常用的治理海上溢油污染的方法主要有物理方法、化學方法和生物方法三種方法。與物理化學修復手段相比，生物修復具有成本低、無二次污染、處理效果好等優點，在諸多含油海水處理方法中被認為是最有應用前景的處理技術[3]，并已有生物修復法治理石油污染的實例[4]。目前，已報道的石油降解菌有數百種，涉及數十個屬[5]，如芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、脫硫菌(Desulfosarcina)、紅球菌(Rhodococcus)等[6-9]。由于海水較高的鹽度制約著石油降解菌的生長及降解效率，傳統的非耐鹽菌株并不適合對高鹽環境進行生物修復。因此，海洋來源的耐鹽石油降解菌在海上溢油處理中具有更好的應用前景[10]。

本課題組在前期的研究中，從渤海入海口的泥沙中分離獲得一株可降解石油的菌株SI-JHS，鑒定為假交替單胞菌(Pseudoalteromonsp.)，能夠以石油為唯一碳源。本研究以SI-JHS為出發株，采用Plackett-Burman設計法和響應面分析法[11]對石油降解菌SI-JHS降解石油的發酵培養基進行優化，確定培養基主要影響因子及其最佳添加量，為海洋溢油的生物降解提供前期技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌種

海洋石油降解菌SI-JHS(Pseudoalteromon sp.)為本實驗室保存，篩選自渤海入海口處的修船廠灘涂。

1.2 培養基

種子培養基：蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 值7.0，固體培養基添加1.5%～2%瓊脂粉。該培養基用于菌株的保存和傳代培養。

初始發酵培養基：NaCl 35.0 g，K2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NH4NO31.0 g，酵母提取物 0.01 g，蒸餾水補足1 L，pH值7.5。121 ℃，高壓滅菌20 min。石油含量1 g·L-1。

1.3 實驗設計和方法

1.3.1 菌株的活化

將保存的海洋石油降解菌SI-JHS轉接于LB固體培養基，30℃培養2 d。挑取單菌落接種到LB液體培養基中，30℃，160 r/min搖床培養過夜，按1%接種量將種子液轉接到發酵培養基中，進行條件摸索試驗。

1.3.2 Plackett-Burman實驗

采用Design expert 軟件，選擇石油降解菌SI-JHS培養基中的5個因子，進行Plackett-Burman實驗設計，考察石油降解率。實驗各因素的水平設置見表1。

表1 Plackett-Burman實驗因素編碼及水平

1.3.3 最陡爬坡實驗

根據Plackett-Burman試驗篩選出的顯著影響因子的正負效應，設計最陡爬坡實驗路徑和步長，使生物表面活性劑產量逼近最佳值反應區域[12]。

1.3.4 響應面分析

利用Design-Expert8.06軟件進行2因子3水平Central Composite Design的中心組合試驗設計，確定顯著因子的最佳水平。

1.3.5 石油降解率測定

采用紫外分光光度法繪制石油含量的標準曲線[13]。試管中加入50 μL硫酸溶液進行酸化，加1 mL正己烷萃取，萃取液轉移至25 mL離心管， 160 r/min震蕩 2 min，10000 r/min離心3 min，測定其上層液體于波長227 nm處的吸光度(以A1表示)。同時以未加菌株的篩選培養基為空白對照，測定其上層液體于波長227 nm處的吸光度(A0)，將吸光度帶入石油標準曲線，計算石油含量(C0為空白對照石油油含量，C1為降解后殘余石油含量)。降解活性以降解率表示：

2 結果與討論

2.1 Plackett-Burman實驗

采用初始發酵培養基培養海洋石油降解菌SI-JHS時，石油降解率可達到70%。在此基礎上優化培養基組分。以發酵培養基5種成分作為5各因素，選用實驗次數為N=12的實驗方法進行PB實驗設計，X1、X3、X5、X7、X9分別代表磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硝酸銨、酵母提取物，設計X2、X4、X6、X8、X10空白作為誤差分析項。每個因素分別選取了高水平(+1)和低水平(-1)，以石油降解率作為響應值。PB實驗設計和響應值見表2，每個實驗設兩個平行樣，結果取平均值。

表2 Plackett-Burman實驗設計和響應值

利用Design-expert8.06軟件對PB試驗結果進行方差分析，由石油降解率影響因素主效應分析結果見表3。

表3 石油降解率影響因素主效應分析結果

由表3可以看到，回歸模型的P值為0.0053(P<0.05)，說明該模型顯著，在整個的實驗數據區間內擬合較好。各變量對響應值影響顯著性油F值檢驗來判定，P值越小，響應變量的顯著程度越高。培養基中各因素對石油降解率影響效應大小順序依次為：硝酸銨>硫酸鎂>磷酸氫二鉀>磷酸二氫鉀>酵母提取物，其中硝酸銨(P=0.0005)、硫酸鎂(P=0.0201)是主要的影響因子(P<0.05)，其他因素對發酵液表面張力變化影響不顯著。因此，選擇硝酸銨和硫酸鎂這兩個因素進行更深入的研究。

2.2 最陡爬坡實驗

表4 最陡爬坡實驗設計和結果

分析Plackett-Burman實驗結果確定硝酸銨和硫酸鎂為主要的影響因素，硫酸鎂對石油降解率起負效應，即硫酸鎂濃度越高，石油降解率越小。硝酸銨對石油降解率影響為正效應，提高硝酸銨的含量，可以提高石油降解率。根據PB實驗結果，確定兩個影響因子的實驗范圍和爬坡步長，設計最陡爬坡路徑(表4)。

通過表4實驗結果可以看出，石油降解率變化趨勢為先升高再下降，在第8組實驗中石油降解率最大，因此選擇第8組實驗的各因素作為響應面實驗的中心點，即硫酸鎂0.75 g/L，硝酸銨2.0 g/L。

2.3 響應面分析

根據PB實驗和最陡爬坡實驗結果，對2個影響顯著的因子硫酸鎂和硝酸銨進行中心組和設計結合響應面分析，以確定他們的最佳值，獲得最佳石油降解效果。實驗因子水平及編碼見表5，共計13組實驗，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀、酵母提取物濃度分別為1 g/L，1 g/L，0.01 g/L。

表5 中心組和設計及結果

以石油降解率為響應值，Design of experiments8.06軟件分析實驗數據，結果如表6所示。

表6 方差分析

對中心組和設計確定的各參數取值范圍進行響應面分析，結果如圖1所示。

圖中顯示硫酸鎂和硝酸銨對石油降解率的交互影響的三圍曲面圖和相應等高線圖，回歸模型的最佳值存在響應面最低點，等高圖的圓心。通過Design of experiments8.06軟件計算，得出發酵液表面張力最低時培養基成分為：氯化鈉35 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.89 g/L，硝酸銨2.11 g/L，酵母提取物0.01 g/L，在此優化條件下，發酵液的對石油降解率達到80.5%。

圖1 硫酸鎂和硝酸銨交互影響的三維曲面圖和相應等高線圖

2.4 搖瓶發酵優化試驗結果驗證

為了驗證理論值與實驗值的符合性，按照優化后發酵培養基配方對菌株SI-JHS發酵液對降解效果進行驗證實驗，實驗測得平均降解率為80.8%，與預測值基本符合，證實了模型的有效性。

3 結論

海洋來源的石油降解菌在海上溢油的生態修復技術方面具有良好的應用前景。本研究利用Plackett-Burman實驗對菌株SI-JHS降解石油的培養基組分進行優化。結果表明，硝酸銨和硫酸鎂為顯著影響因子，通過最陡爬坡實驗和中心組和設計實驗，建立硝酸銨和硫酸鎂的二次回歸方程，經驗證實驗證明了該模型可靠性，最終獲得海洋石油降解菌SI-JHS降解石油的最佳培養基配方為：氯化鈉35 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.89 g/L，硝酸銨2.11 g/L，酵母提取物0.01 g/L。使用優化條件培養海洋石油降解菌SI-JHS，石油降解率為80.8%，與預測值接近，比優化前提高了14.2%。