納米ZnO對小麥秸稈還田土壤中土壤呼吸及土壤酶活性的影響

姜 浩，楊寶山，王 惠，曹鑫磊，高永超，吳慶通

(1.濟南大學 水利與環境學院，山東 濟南 250022； 2.齊魯工業大學(山東省科學院)生態研究所 山東省應用微生物重點實驗室，山東 濟南 250013)

納米ZnO(ZnONPs)作為常見的納米材料之一，因其具有傳統大顆粒ZnO的特性和其自身獨特的納米特性[1-2]，在催化劑、化妝品和紡織品等領域得到廣泛的應用[3-5]。ZnONPs的廣泛生產和應用增加了其在環境中的大量釋放[4-5]。ZnONPs作為一類重要的無機納米材料，已有學者指出，其對土壤微生物的毒性比有機納米顆粒更大[6]。此外，這些金屬氧化物納米顆粒還可通過對微生物代謝的毒性作用，影響土壤生態系統的養分循環[7]。

還田秸稈是土壤中有機質和土壤養分的主要來源之一。據統計，近年來小麥秸稈的產量每年達到1.54×108～1.85×108t[8]，通過秸稈還田對其進行處理，是減少環境污染，增加土壤有機碳含量的重要途徑[9-10]。土壤呼吸是土壤碳素排放到大氣的主要途徑[11]，是農田生態系統中土壤碳排放的一個重要組成部分[12]。納米顆粒在土壤中的大量積累可能會對土壤呼吸及相應的微生物活性產生影響。但關于秸稈還田條件下ZnONPs對土壤呼吸作用影響的研究，目前還未見開展。因此，開展ZnONPs對小麥秸稈還田后土壤呼吸的影響的研究，探明ZnONPs對土壤碳循環過程的影響，分析其影響因素，對ZnONPs環境風險評價具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

ZnONPs購自北京博宇高科新材料技術有限公司，淡黃色粉末，純度為99.9%，平均粒徑約14.6 nm，比表面積為51.5 m2/g。

小麥秸稈采自當地收割后的新鮮小麥，帶回實驗室后風干并粉碎至2 cm以下。

1.1.2 土壤采集

土壤樣品于2018年3月采自山東省濟南市章丘區(117°23′31.11″E，36°40′5.23″N)冬小麥-夏玉米輪作農田土壤，土壤類型為潮土，取樣深度為0 ～ 20 cm。土壤樣品采集后迅速帶回實驗室，去除可見根系、有機碎屑和石頭等，將新鮮土樣充分混勻后過2 mm篩，并測定土壤基本理化性質：pH值為7.35，w(含水量)為10.13%，w(有機質)為1.66%，w(銨態氮)為8.03 mg/kg，w(硝態氮)為6.18 mg/kg，w(總氮)為0.83 g/kg，備用。

1.2 試驗設計

為穩定土壤微生物活性，在試驗開始前將供試土壤在(25 ± 3)℃，黑暗條件下預培養2周，期間調節土壤含水量為最大持水量(w)的50%[13]。試驗設無任何添加的處理(CS)，秸稈還田處理(5 g/kg)[14](SW)和秸稈還田(5 g/kg)并添加ZnONPs(500 mg/kg)[12]3個處理，每個處理重復3次。

將預培養的土壤分裝于9個2.5 L的廣口瓶底部，每個瓶中裝相當于50 g干重的土壤，將ZnONPs和小麥秸稈均勻混合于土壤中，調節土壤含水量至最大持水量的50%，內置裝有25 mL NaOH(0.1 mol/L)溶液的50 mL燒杯，蓋上瓶塞，用真空硅脂密封。廣口瓶置于溫室中，溫度保持在(25 ± 3)℃、黑暗條件下進行室內礦化實驗，分別在第2、4、7、14、21、28、42、56天取出燒杯。用0.05 mol/L HCl反滴定法確定CO2釋放量，計算CO2累積排放量[15]。分別在第7、14、56天進行破壞性取樣，存于4℃冰箱，用于進行土壤酶活性、土壤理化性質和微生物生物量的測定。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤pH值的測定

土壤pH值選用水土比2.5∶1(V/m)采用酸度計測定[4]。

1.3.2 土壤酶活性測定

土壤過氧化物酶的測定采用鄰苯三酚比色法[16]，其活性以每克土壤2 h內生成焦性沒食子酸的毫克數來表示；土壤纖維二糖水解酶的測定由上海通蔚生物科技有限公司利用試劑盒完成，其單位為每克土壤消耗國際單位酶量；β-葡萄糖苷酶的測定采用硝基酚比色法[17]，其活性以每克土壤1 h產生的對-硝基酚的微克數表示。

1.3.3 土壤MBC和微生物吸收Zn2+數量測定

土壤MBC的測定采用氯仿熏蒸-硫酸鉀提取的方法[4]。微生物中Zn2+含量的測定采用氯仿熏蒸-硝酸銨提取的方法[15]。

2 結果與討論

2.1 ZnONPs對土壤呼吸的影響

ZnONPs改變了小麥秸稈還田土壤中CO2的釋放(圖1)。從第4 d開始，秸稈添加處理中CO2的釋放均顯著高于對照組，且隨著天數增加，差異性越明顯。與SW處理相比，ZnONPs添加后CO2的釋放在整個培養過程中都被抑制，但土壤呼吸作用釋放的CO2顯著高于對照。在56 d前，SW與SWZ處理間無顯著差異。可見，在培養期間，加入小麥秸稈后土壤呼吸作用顯著提高，但在ZnONPs處理中CO2的釋放明顯降低，表明ZnONPs對添加小麥秸稈后的土壤呼吸具有一定的抑制作用。當ZnONPs暴露于土壤中時，對ZnONPs敏感的微生物會受到抑制，這可能是ZnONPs進入土壤后呼吸速率下降的原因[15]。

圖1 三種處理條件下CO2釋放量的變化

2.2 ZnONPs對土壤酶活性的影響

圖2 ZnONPs和小麥秸稈對過氧化物酶(A)，纖維二糖水解酶(B)和β-葡萄糖苷酶(C)的影響

在添加ZnONPs和小麥秸稈的條件下，3種土壤酶活性產生不同的變化(圖2A,2B和2C)。第7 d時，過氧化物酶活性在秸稈處理下最高，ZnONPs添加后其活性降低，而在14 d和56 d后，過氧化物酶活性在各處理間無顯著差異(圖2A)。在整個培養過程中，添加秸稈的處理組中纖維二糖水解酶的活性顯著升高；其中，ZnONPs處理下的纖維二糖水解酶活性在第7 d和56 d顯著低于秸稈添加處理，但在第14 d時無顯著差異(圖2B)。過氧化物酶和纖維二糖水解酶的活性均隨著培養天數升高而增加。可見，ZnONPs對過氧化物酶和纖維二糖水解酶的抑制效果較為顯著。重金屬可以與巰基反應形成金屬巰蛋白，從而使酶失去活性或受到抑制[18]。在7 d和14 d后，雖然ZnONPs對β-葡萄糖苷酶活性存在抑制作用，但沒有顯著差異，而在實驗過程的最后階段(56 d)，在添加ZnONPs的處理中，β-葡萄糖苷酶活性顯著高于對照組(圖2C)。此外，β-葡萄糖苷酶活性隨著培養天數的增加有略微降低。纖維素是秸稈中易分解的不穩定的成分，通常比木質素降解的更快[19]，這可能是其隨培養天數的增加而降低的主要原因。

2.3 ZnONPs對pH值和微生物中Zn2+含量的影響

如表1所示，在整個培養過程中，SW處理的pH值均略低于CK和SWZ處理。在第7 d，SWZ相較于SW顯著提高了3.9%；然而14 d后，SW比對照組降低了3.1%，而SWZ比SW的pH值提高了3.6%；培養56 d后，SW與對照組相比降低了1.7%。可見，小麥秸稈添加后，土壤pH值降低，表明外源有機質的添加可影響土壤化學性質；而添加ZnONPs土壤的pH值與對照相比無顯著差異，表明ZnONPs的暴露抑制了有機質的分解。事實上，小麥秸稈的分解增加了CO2釋放，是土壤pH值降低的可能原因之一。植物殘體富含木質素、纖維素和酚類化合物，分解后會在土壤中產生有機酸，也可能導致土壤pH值的降低[15]。此外，SWZ處理的微生物中Zn2+的濃度是對照組的3.4倍，表明ZnONPs添加后釋放的Zn2+可被微生物吸收。

表1 ZnONPs和小麥秸稈對土壤pH值和微生物中Zn2+的影響

2.4 ZnONPs對MBC的影響

如圖3所示，添加秸稈和ZnONPs后，同一天數不同處理之間及同一處理不同培養天數之間的土壤微生物量碳含量均不存在顯著差異。然而，Rashid等[33]發現，高濃度氧化鐵納米顆粒(2000 mg/kg)降低了MBC。由此可見，MBC的變化與NPs的劑量和種類有關，本研究中，ZnONPs在500 mg/kg濃度下，對土壤微生物量影響較小。

圖3 ZnONPs和小麥秸稈對微生物生物量碳的影響

3 研究結論

(1)小麥秸稈的添加增強了土壤呼吸作用及過氧化物酶、纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶活性，顯著促進了土壤中的碳循環過程。

(2)ZnONPs對土壤呼吸和纖維二糖水解酶具有抑制作用，抑制作用的大小隨著培養時間的延長而增大。ZnONPs添加后，微生物中Zn2+的含量顯著增加。