星點設計法優化瑪咖中總黃酮的提取工藝

郭雅麗，王 易，張 邈，程玉蕾，張德娥，李佳藝，肖 莉

(湖州師范學院 生命科學學院，浙江 湖州 313000)

瑪咖有“秘魯人參”之稱，是一種傳統的藥食兩用型植物，目前在我國云南地區廣泛種植[1]。臨床藥理研究結果顯示，瑪咖富含生物堿、瑪咖酰胺、瑪咖烯、黃酮、多糖等次生代謝產物，具有改善性功能、抗疲勞、抗氧化等功效，藥用價值較高，受到人們的廣泛關注[2-4]。目前對瑪咖中活性成分的研究主要集中于瑪咖酰胺、瑪咖烯及多糖等，對瑪咖中黃酮成分的研究則較少。本研究以瑪咖總黃酮為指標，在單因素實驗的基礎上，利用星點設計-響應面優化法對超聲波輔助提取瑪咖總黃酮的提取工藝進行優化，為瑪咖總黃酮源的綜合利用提供參考[5-6]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

電子分析天平，Mettler Tlledo；756CRT紫外可見分光光度計，上海佑科；高速多功能粉碎機，上海舍巖；旋轉蒸發儀，上海亞榮；抽濾真空泵，鄭州長城；超聲波清洗器，上海閣凌。

1.2 試藥

瑪咖原粉，產自云南，曬干后加工為瑪咖粉；蘆丁標準品，中國藥品生物制品檢定所，批號：F20171108；無水乙醇、95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等，均為國產分析純。

2 實驗方法

2.1 瑪咖總黃酮的測定

2.1.1 標準儲備液的配制

精密稱取一定量的蘆丁對照品置于50 mL容量瓶中，加入適量95%乙醇超聲處理使溶解后，續加95%乙醇稀釋定容至刻度，搖勻，得到0.200 mg/mL的標準儲備液備用。

2.1.2 標準曲線的繪制

分別精密吸取標準儲備液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL置于10 mL容量瓶中，依據顯色條件依次加入亞硝酸鈉溶液、硝酸鋁溶液、氫氧化鈉溶液，并在510 nm波長處依次測定吸光度，得到線性回歸方程為：A=5.0378C-0.011，R2= 0.9968，表明在0.04～0.14 mg/mL范圍內，吸光度與濃度線性關系良好。

2.1.3 總黃酮含量的測定

精密吸取一定量的瑪咖提取液，按2.1.3項方法測定吸光度，代入回歸方程，計算得到瑪咖總黃酮含量，根據下述公式，計算得瑪咖總黃酮提取率。

C為提取液中瑪咖總黃酮濃度(mg/mL)，V為提取液體積(mL)，M為瑪咖藥材粉末投料量(g)。

2.2 單因素考察

2.2.1 乙醇濃度

精密稱取瑪咖粉末10.00 g，固定料液比為1∶7，超聲時間為30 min，考察在40%、50%、60%、70%、80%乙醇濃度條件下總黃酮的提取率。

2.2.2 料液比

密稱取瑪咖粉10.00 g，固定乙醇濃度為60%，超聲時間30 min，分別考察在料液比(g/mL) 為1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13的條件下總黃酮的提取率。

2.2.3 提取次數

密稱取瑪咖粉末10.00 g，固定乙醇濃度為60%，料液比為1∶7，超聲時間為30 min，考察提取次數為1次、2次、3次時總黃酮的提取率。

2.2.4 提取時間

精密稱取瑪咖粉末10.00 g，固定乙醇濃度為60%，料液比為1∶7，考察分別在超聲時間10、20、30、40、50 min 條件下總黃酮的提取率。

2.3 響應面優化提取工藝

單因素試驗的結果，只能得到單因素對提取率的影響，無法獲得單因素之間的交互作用結果。本實驗在單因素實驗的基礎上，根據星點設計原理，選擇乙醇濃度(A)、料液比(B)及提取時間(C)3個影響因素為自變量，以瑪咖總黃酮提取率為響應值，設計3因素5水平響應面分析方法優化提取工藝，采用Design-Expert v8.0進行試驗結果分析。因素水平表見表1。

表1 響應面因素水平表

3 實驗結果與討論

3.1 單因素實驗結果

圖1 乙醇濃度、料液比、提取時間及提取次數對瑪咖總黃酮提取率的影響

Fig.1 Effect of ethanol,material-liquid ratio,extraction time,frequency on extraction rate of flavonoids from Maca

單因素實驗結果如圖1所示。由圖可知，當乙醇濃度為60%時測得瑪咖總黃酮提取率最高，這可能是由于瑪咖黃酮中主要成分為中等極性的黃酮苷類物質，隨著提取溶劑中乙醇體積分數的增加，體系的極性下降，從而降低了黃酮苷類物質的溶出。隨著超聲時間的延長，瑪咖總黃酮的提取率出現先增加后降低的趨勢，當超聲時間為30 min時，瑪咖總黃酮提取率達到最高值0.58%。這是由于隨著超聲時間的延長，瑪咖總黃酮逐漸達到溶出平衡，超過30 min時，瑪咖中雜質成分的溶出也隨之增加，從而干擾瑪咖總黃酮的測定。當料液比達到1∶7時，瑪咖總黃酮提取率達到最高值。究其原因，可能是由于此時瑪咖中的黃酮成分已基本溶出完全，進一步提高料液比也無法提高提取率，從而造成溶劑的浪費。瑪咖總黃酮提取率雖然隨提取次數的增加有所升高，但升高并不明顯，從實驗效果與成本等多方面考慮，因此確定最佳提取次數為1次。根據單因素實驗結果，確定后續響應面優化的各自變量范圍為：乙醇濃度50%～70%，超聲時間20～40 min，料液比1∶5～1∶9。

3.2 響應面優化提取工藝結果

采用星點設計原理設計瑪咖總黃酮提取實驗安排及實驗結果見表2。

表2 星點實驗設計及結果

以瑪咖總黃酮提取率為指標(R1)，采用Design-expert8.0.6軟件對響應值與各因素進行回歸擬合，得到的回歸方程為：

R1=0.98-0.13A-0.056B+0.028C+0.051AB-0.026AC+0.011BC-0.19A2-0.082B2-0.19C2

表3 回歸模型方差分析

注: *P<0.05;＊＊P<0.01;＊＊＊P<0.001

3.3 交互作用對瑪咖總黃酮提取率的影響

相對于三個單因素其中兩個因素，通過Design-expert軟件繪制三維響應面圖，進一步分析各因素交互作用對瑪咖總黃酮提取率的影響。響應面的平緩程度，直觀地反映了各自變量發生變化時瑪咖總黃酮提取率的響應靈敏程度。

圖2 兩因素交互作用對瑪咖總黃酮提取率影響的響應面圖

圖2中的三維效應面圖可以反映出乙醇濃度(A)、提取時間(B)和溶劑倍數(C)的交互作用對瑪咖總黃酮提取率的影響。AB、AC、BC的曲面坡度均較為平緩，故其對瑪咖總黃酮提取率的影響不顯著，與方差分析的結果一致。

3.4 最優方案的驗證

設置瑪咖總黃酮提取率目標值為最大值，通過Design-Expert 軟件分析出最佳提取工藝為：乙醇濃度57.58%，提取時間27.35 min，料液比1∶7.10，60℃下提取1次，瑪咖總黃酮理論提取率為1.01%。按此工藝平行實驗三次，得到的瑪卡總黃酮平均提取率為0.99%，實測值與預測值差別不大，說明該工藝穩定可靠。

4 結論

本研究采用星點設計-效應面優化法，可以直觀反映出各個因素對瑪咖總黃酮提取率的影響。二項式擬合結果顯示相關系數R為0.9763，說明本次建立的擬合模型較為成功，預測性良好。獲得最佳提取條件為：乙醇濃度57.58%，提取時間27.35 min，料液比1∶7.10，60℃下提取1次，在此條件下瑪咖總黃酮提取率為0.99%，為瑪卡總黃酮的提取應用提供一定的參考。