11種植物精油對2種棉花病原菌的抑菌活性

趙娜娜，盧若濱，加米古麗·木斯爾汗，陳瑞琪，楊文睿，王 悅，路 偉

(1.新疆農業大學農學院，烏魯木齊 830052；2. 云南農業大學，昆明 650201)

0 引 言

【研究意義】新疆是我國最大的優質棉生產基地，棉花生產面積、單產和調出量連續24年位居全國之首，2017年新疆棉花播種面積228.11×104hm2，其種植面積約占全國種植面積的70%以上[1]。在棉花生長期會發生多種病害，造成籽棉產量損失和質量下降，使得其經濟價值大大降低。其中，串珠鐮刀菌引起的棉花紅腐病是一種危害較大的苗期病害，主要引起棉花種子腐爛、根部腐爛、芽部腐爛和莖基腐爛[2]。目前對棉花紅腐病、棉花枯萎病的防治采用綜合治理的策略與方法，化學防治因具有見效快、經濟等優點，仍是目前病害控制的有效途徑。隨著化學藥劑使用年限的增加，植物病原真菌對殺菌劑的抗性變得越來越明顯，兼之棉田連作，使得化學防效越來越差，棉花病害的發生呈現日益加重的趨勢，亟需尋找新型綠色環保替代藥劑。【前人研究進展】近年來隨著轉Bt基因抗蟲棉的推廣種植，此病的發生危害逐漸加劇，給棉花生產帶來較大的挑戰，嚴重影響新疆經濟發展[3]。尖孢鐮刀菌(萎蔫專化型)引起的棉花枯萎病是棉花成株期主要病害之一，對棉花的維管束等部位造成危害，導致葉片枯死或脫落，棉花枯萎病作為土傳病害是制約棉花產量的重要因素之一，每年給棉花帶來的經濟損失在5%～30%，嚴重影響棉花的產量和纖維品質，甚至可以造成絕產[4]。【本研究切入點】植物精油是從植物中萃取的特有芳香物質，由多種化合物共同組成，成分復雜，主要成分為萜烯、倍半萜烯及其氧化物，此外還有醛、酮、酯、酸等，其中具有抗真菌活性的為醛類、醇和酚類化合物[5]。據文獻研究表明，大蒜、丁香、肉桂等香辛料精油在殺菌劑方面具有較大的應用潛力[6, 7]。【擬解決的關鍵問題】通過水蒸氣蒸餾法提取11種香辛料植物的精油，采用生長速率抑制法測定精油對尖孢鐮刀菌萎蔫專化型、串珠鐮刀菌的抑制活性，評價11種香料植物精油對棉花枯萎病病菌、棉花紅腐病病菌的生物活性，為植物源殺菌劑的開發應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 香料植物

11種香料植物購買于新疆烏魯木齊市北園春菜市場，植物標本均保存于新疆農業大學農學院天然產物與化學實驗室。表1

表1 11種植物采集名錄Table 1 11 plants directory

1.1.2 棉花病原菌

供試菌：尖孢鐮刀菌萎蔫專化型(Fusariumoxysporumf.sp. vasinfectum)和串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)分離自發病棉花，由新疆農業大學植物病理學實驗室提供，菌種現保存于該實驗室。

供試培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基( PDA) ：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 試劑與儀器

儀器：連續蒸餾裝置，北京玻璃儀器廠；DZTW型調溫電熱套，北京市永光明醫療儀器有限公司；SHZ-DIII循環水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器有限責任公司；RE-52CS型號旋轉蒸發器，上海振捷實驗設備有限公司； LE204E電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；PQX-280B-22H人工氣候箱，寧波萊福科技有限公司。

化學試劑：正己烷、無水硫酸鈉(分析純)均購自天津化學試劑公司。

1.2 方 法

1.2.1 植物精油的提取

植物材料：市場購買荊芥、大蒜、香葉、八角、茴香、孜然、花椒、青花椒、桂皮、丁香和黑胡椒各3 kg。

將適量植物材料放入到3 000 mL的圓底燒瓶中，加1 500 mL水，用水蒸氣蒸餾法蒸餾6 h，所得油水混合物用正己烷萃取，萃取所得物用無水硫酸鈉脫水后，用旋轉蒸發器減壓蒸發濃縮(40℃)，回收正己烷，所得殘留的油狀液即為精油，測比重，放入棕色瓶中密封保存，置于4℃冰箱中備用。

1.2.2 生長速率抑制法測定植物精油的抑菌活性

用瓊脂稀釋法結合菌絲生長速率法，測定精油的抑菌活性。用正己烷將11種精油分別稀釋成50 和5 μL/mL 2個濃度，用移液槍吸取0.5 mL已稀釋的精油溶液加入49.5 mL PDA 培養基中混勻，1 mL培養基中分別含有0.5、0.05 mg植物精油，將培養基倒入直徑90 mm的培養皿，倒3皿。選擇事先培養好的生長均勻的病原菌菌落，沿其邊緣用打孔器打直徑5 mm的菌餅。待含精油的培養基凝固后將5 mm的菌餅置于培養基中心。對照加0. 5 mL的正己烷代替精油溶液。將培養皿放置于溫度為25℃的培養箱中培養6～9 d，待對照快要長滿培養皿時用十字交叉法測量菌落直徑( mm) ，取平均值，重復3 次。

1.2.3 測定活性精油的EC50

選取抑菌活性較好的精油，分別稀釋成系列濃度梯度的含藥培養基，測定不同質量濃度精油的抑菌活性，計算精油菌絲生長的抑制率，并根據幾率值分析法求毒力回歸方程和有效中濃度(EC50)。

1.3 數據處理

利用Microsoft Excel 和SPSS 19. 00 軟件對試驗數據進行處理和分析，按照式(1)計算相對抑制率。

相對抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-5)×100%。

(1)

2 結果與分析

2.1 11種植物精油對尖孢鐮刀菌(萎蔫專化型)的抑菌活性

研究表明，在質量濃度為0.5 g/L時，肉桂油和大蒜油的抑菌活性高達100%，荊芥油的抑菌活性也較高，為95.56%；其次為八角油和丁香油，抑菌活性分別83.06%和80.86%。在質量濃度為0.05 g /L 時，孜然油抑菌活性最高，為28.01%，其次為大蒜油，抑菌活性為25.56%，稍弱的是肉桂油、丁香油和八角油，抑菌活性分別為20.89%、20.88%和20.80%，三者之間無顯著差異。除月桂、黑胡椒、茴香、花椒之外，剩余7種植物精油對尖孢鐮刀菌均具有較強的抑菌活性，其中肉桂油、大蒜油的活性最好，荊芥油、八角油和丁香油次之。 表2

表2 11種植物精油對尖孢鐮刀菌的抑菌活性Table 2 Fungicidal activity of 11 essential oils against F. oxysporum

注: 數據后的不同小寫字母表示在方差分析( Duncan 新復極差法) 中于0. 05 水平上差異顯著
Note：Data were presented as mean±SD, data with different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level

2.2 11種植物精油對串珠鐮刀菌的抑菌活性

研究表明，在質量濃度為0.5 g /L時，肉桂油和丁香油的抑菌活性高達100%，其次為大蒜油、荊芥油和花椒油，抑菌活性分別為93.99%、92.31%和92.31%。在質量濃度為0.05 g/L 時，大蒜油抑菌活性最高，為36.22%，其次為茴香油，抑菌活性為25.44%，稍弱的是荊芥油和花椒油，抑菌活性分別為23.20%、23.20%，二者之間無顯著差異。結果表明,肉桂、丁香、大蒜、荊芥、花椒、孜然6種植物精油對串珠鐮刀菌均具有較強的抑菌活性，其中肉桂油、丁香油的活性最好，大蒜油、荊芥油、花椒油和孜然油次之。 表3

2.3 4種活性精油對尖孢鐮刀菌的EC50

生長速率法測定4種植物精油對尖孢鐮刀菌的EC50值，研究表明，肉桂、大蒜、荊芥和孜然的EC50值均在110 mg /L 以下，分別為22.89、51.33、79.71 和101.97 mg /L，4種植物精油對尖孢鐮刀菌的抑菌活性較好，尤其是肉桂油，活性最強。表4

2.4 3種活性精油對串珠鐮刀菌的EC50

生長速率法測定3種植物精油對串珠鐮刀菌的EC50值，研究表明，肉桂、大蒜和丁香的EC50值均在150 mg /L 以下，分別為8 315、123.33和99.20 mg /L，3種植物精油對串珠鐮刀菌的抑菌活性較好，尤其是肉桂油，活性最強。表5

表3 11種植物精油對串珠鐮刀菌的抑菌活性Table 3 Fungicidal activity of 11 essential oils against F. moniliforme

注: 數據后的不同小寫字母表示在方差分析( Duncan 新復極差法) 中于0.05 水平上差異顯著
Note：Data were presented as mean±SD, data with different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level

表4 4種高活性植物精油對尖孢鐮刀菌的EC50值Table 4 EC50 value toxicity test of 4 essential oils against F. oxysporum

表5 3種高活性植物精油對串珠鐮刀菌的EC50值Table 5 EC50 value toxicity test of 3 essential oils against F. moniliforme

3 討 論

近年來，植物源殺菌劑的開發和研究引起了許多研究者的關注，已成為農藥研究領域的熱點[8]，由于植物源殺菌劑來源于植物體，除具有無污染、不殺傷靶標生物、不殘留、不易產生抗性等特點，還能修復傷口、營養復壯、提高作物免疫力[9]，因此，從植物中尋找抑菌活性物質仍然是近幾年來開發研制新型殺菌劑的熱點之一。

八角、茴香、大蒜等除了作為調料調劑食物的味道，還具有殺菌活性。如青花椒油能有效抑制白地霉、金黃色葡萄球菌、產朊假絲酵母、煙曲霉、熱帶假絲酵母、黑曲霉和大腸桿菌等菌絲的生長[10]；粉紅單端孢、鏈格孢菌、青霉、大腸桿菌、熒光假單孢菌和枯草芽孢桿菌等病原菌在含有丁香、孜然和肉桂精油的培養基中生長較弱[11]；月桂精油與肉桂精油對終極腐霉、6種病原真菌：灰葡萄孢、茄鐮孢菌、瓜果腐霉以及禾谷鐮孢菌5種病原真菌均具有一定的抑制效果[12]；八角與茴香精油能抑制酵母菌、枯草芽孢桿菌、金葡菌與大腸桿菌4種病原菌的菌落生長和產孢量[13]；在對產氣莢膜梭菌的抑制試驗中發現肉桂、黑胡椒與茴香精油對其有抑制效果[14]，黑胡椒精油對5種病原菌：西瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌、梨黑斑病菌、小麥赤霉病菌與番茄灰霉病菌具有一定的抑制作用[15]；大蒜精油對8種病原菌：表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌、綠膿桿菌、白色念珠菌和黑曲霉均具有一定的抑制作用，甚至對白色念珠菌、黑曲霉和表皮葡萄球菌具有一定的致死作用[16]。

但香辛料植物多應用在食品和醫藥上，僅有少數文獻研究了植物精油對植物病害的抑菌研究。所以，研究采用菌絲生長速率法測定了11種精油對4種植物病原真菌的抑制活性。在質量濃度為0.5 g /L時，11種植物精油均對棉花枯萎病具有一定的抑制作用，肉桂油和大蒜油的抑菌活性高達100%，荊芥油和孜然油的抑菌活性也較高，EC50值較低，活性好于其余7種精油，目前，在棉花枯萎病的生物防治方面，前人通過生防菌防治棉花枯萎病從而降低其病情指數和發病率[17]，但并未出現用植物精油防治的案例，具體防治效果還需進一步研究。在質量濃度為0.5 g /L時，11種植物精油均對棉花紅腐病具有一定的抑制作用，肉桂油和丁香油的抑菌活性高達100%，其次為大蒜油、荊芥油和花椒油，在質量濃度為0.05 g /L 時，大蒜油抑菌活性最高。肉桂、大蒜和丁香的EC50值均在150 mg /L 以下，與已有藥劑相比，雖不如40%甲基托布津膠懸劑(EC50值為43.40 mg /L)，但好于40%硫磺膠懸劑(EC50值為184.44 mg /L)[18]，表明3種植物精油的抑菌活性較好，具有開發為天然殺菌劑的潛力，為殺菌劑開發應用提供有效的抑菌成分，

植物精油組成成分復雜，包含有幾十種化合物，但其主要成分以萜烯及其氧化物和倍半萜烯為主，此外還有酯、酸、醛、酮等[19, 20]，化學成分復雜，究竟是哪一種化學成分具有抑菌活性并不清楚。且由于植物精油是一種混合物，可以活性追蹤為指導對精油進行分離純化，找出抑制4種病原真菌的關鍵活性成分。關鍵活性成分可作為先導化合物，以其為模板合成新型殺菌劑，為植物病害的生物防治提供新型藥劑，新殺菌劑因來源于自然，減緩抗藥性的產生。

4 結 論

肉桂油、大蒜油、荊芥油3種精油對尖孢鐮刀菌(萎蔫專化型)、串珠鐮刀菌均有較好的抑菌效果，孜然油對尖孢鐮刀菌(萎蔫專化型)有較好的抑菌效果，丁香油對串珠鐮刀菌有較好的抑菌效果，5種高活性植物精油具有開發為天然殺菌劑的潛力。