棘胸蛙白內障病癥的致病菌鑒定及其敏感藥物篩選

楊瀅 張雪萍 吳銳瓊 黃其鍛 李達諒 陸永樹 耿寶榮 陳友鈴 黃鎮

摘 要：棘胸蛙Quasipaa spinosa是福建省特色有藥用和食用價值的蛙類品種，目前棘胸蛙的養殖已經逐步實現規模化，但是養殖中的疾病問題隨著養殖密度的增加逐年加重。白內障病癥是常見的棘胸蛙細菌性疾病之一，為解析棘胸蛙白內障的致病菌以及對該病的防治，對患白內障病棘胸蛙的器官進行病原菌的分離純化并進行鑒定，同時進行了人工感染確定其致病性，最后通過抑菌圈法檢測該菌株對20種抗生素的敏感性。人工感染試驗結果顯示，從患白內障病的棘胸蛙內臟中分離的細菌進行人工感染后，可導致正常蛙出現白內障病的病征，通過16S rDNA序列鑒定為彭氏變形桿菌Proteus penneri。藥敏試驗結果顯示該菌株對氯霉素、多粘菌素B、環丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、米諾環素、新霉素、卡那霉素、慶大霉素、丁胺卡那、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢呋辛、哌拉西林、羧芐西林、氨芐西林敏感，而對其他多種藥物耐受。本研究表明彭氏變形桿菌可導致棘胸蛙出現白內障的病征，為棘胸蛙養殖過程中白內障病的診斷及防治提供了理論基礎。

關鍵詞：棘胸蛙;白內障病;致病菌;彭氏變形桿菌;藥敏試驗

中圖分類號：S947.2 文獻標志碼：A 文章編號：0253-2301（2020）12-0009-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.12.002

Identification of Pathogenic Bacteria of Cataract in Quasipaa Spinosaand the Screening of Its Sensitive Drugs

YANG Ying1， ZHANG Xueping1， WU Ruiqiong1， HUANG Qiduan2，3， LI Daliang4，LU Yongshu5， GENG Baorong1， CHEN Youling1， HUANG zhen1*

（1. Fujian Key Laboratory of Developmental and Neural Biology/College of Life Science， Fujian Normal University，

Fuzhou， Fujian350117， China; 2. Fujian Jianfeng Biotechnology Co. Ltd， Quanzhou， Fujian 362500， China;

3. Fujian Shidongwang Biotechnology Research and Development Center Co. Ltd， Quanzhou， Fujian362500， China

4. Southern Center for Biomedical Research， Fujian Normal University，Fuzhou， Fujian350117， China;

5. Tianfuying Agricultural Professional Cooperative， Nanping Fujian353602， China）

Abstract： Quasipaa spinosa is a typical breed of frog with medicinal and edible value in Fujian Province. At present， the breeding of Quasipaa spinosa has been gradually realized on a large scale， but the problems of diseases in the breeding process are increasing year by year with the increase of breeding density. Cataract is one of the common bacterial diseases of Quasipaa spinosa. In order to analyze the pathogenic bacteria of cataract and to prevent and treat the disease， the pathogenic bacteria were isolated， purified and identified from the organs of Quasipaa spinosa infected with cataract， and then the pathogenicity was determined by artificial infection. Finally， the sensitivity of this strain to 20 kinds of antibiotics was tested by using the inhibition zone method. The results of the artificial infection test showed that after the artificial infection， the bacteria isolated from Quasipaa spinosa infected with cataract could cause the symptoms of cataract in the normal frogs， and the pathogenic bacteria was identified as Proteus penneri by the 16S rDNA sequence analysis. The results of drug sensitive test showed that the strain was sensitive to chlorampenicol， Polymyxin B， ciprofloxacin， ofloxacin， norfloxacin， minocycline， neomycin， kanamycin， gentamicin， amikacin， cefoperazone， ceftriaxone， ceftazidime， cefuroxime， piperacillin， carbenicillin and ampicillin， while was resistant to many other drugs. This study indicated that Proteus penneri could cause the symptoms of cataract in Quasipaa spinosa， which would provide a theoretical basis for the diagnosis and prevention of cataract in the breeding process of Quasipaa spinosa.

Key words： Quasipaa spinosa; Cataract; Pathogenic bacteria; Proteus penneri; Drug sensitive test

棘胸蛙Quasipaa spinosa俗稱石蛙、石雞等，隸屬于兩棲綱無尾目蛙屬，是我國特有的珍貴物種，在我國主要分布在福建、浙江、江西和湖南一帶。由于棘胸蛙肉質鮮美，具有較高的營養價值，廣受人們的喜愛，同時它在中醫藥學方面具有較高的藥用價值，是近幾年來福建和浙江地區蛙類養殖的主要品種之一。2020年以來，受新冠疫情影響，棘胸蛙一度被劃為野生動物禁養，2020年5月28日《農業農村部、國家林業和草原局關于進一步規范蛙類保護管理的通知》頒布，文件中明確了養殖歷史悠久、技術成熟的黑斑蛙、棘胸蛙、棘腹蛙、中國林蛙、黑龍江林蛙等品種按水生動物管理，可以進行人工飼養和食用，為整個棘胸蛙養殖行業發展明確方向。目前棘胸蛙的人工養殖技術已經日趨成熟，但是隨著其養殖規模和密度的不斷擴大，在養殖過程中常爆發細菌性的感染疾病，成為棘胸蛙養殖行業發展中面臨的重大難題，因此解析棘胸蛙的病原菌對于疾病的治療和預防有重要的意義。

爛皮病、歪頭病、出血病及白內障是棘胸蛙養殖過程中較為常見的細菌性疾病。呂耀平等[1]從患爛皮病的棘胸蛙中分離出蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus，并發現蠟樣芽孢桿菌對棘胸蛙的肝、肺、舌和肌肉都造成了嚴重的損傷;王瑞君等[2]發現奇異變形桿菌Proteus vulgaris可使健康的棘胸蛙患爛皮病;宋婷婷等[3]從患病的棘胸蛙中分離出嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila經人工感染后發現該菌可使棘胸蛙的肝臟發生病變甚至可導致棘胸蛙發病死亡;李明等[4]從患有歪頭病的棘胸蛙中分離出腦膜炎敗血金黃桿菌Chryseobacterium meningosepticum，并發現通過注射該菌液或浸泡該菌液均可使棘胸蛙患病死亡;鄭衛軍等[5]發現鮑曼不動桿菌Acinetobacter baumannii可引起棘胸蛙患出血病并使其發病死亡;程曉云等[6]研究發現布氏檸檬酸桿菌Citrobacter braakii可引起棘胸蛙發生白內障的病癥。

白內障病是棘胸蛙常見的細菌性疫病之一，表現為病蛙眼瞼灰白，食欲減退，易死亡，并且有很強的傳染性，給棘胸蛙的生產養殖造成極大的損失[6]。同時白內障病的病原菌存在多樣性，不同的養殖環境下有不同的致病菌。本研究對福建省棘胸蛙養殖場爆發的患白內障病棘胸蛙進行采樣，從病蛙的心、肝、脾、肌肉組織中分離到了1株病原菌，鑒定其為彭氏變形桿菌P.penneri，并通過人工感染試驗確定該病原菌對棘胸蛙的致病性，最后對該菌株進行藥敏試驗，以期為患病棘胸蛙的治療以及日常疾病的監測提供理論指導，降低棘胸蛙白內障的發生。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

患白內障病和健康的棘胸蛙均來自永定縣某養殖場，病蛙平均體重為163 g，健康蛙平均體重為170 g。

1.2 試驗方法

1.2.1 患病棘胸蛙剖檢和組織病理學觀察 取患病棘胸蛙的心、肝、脾、肌肉組織，用4%的PFA（多聚甲醛）溶液于4℃下將組織固定24 h。固定完成后，將樣品放在30%、50%、70%的酒精中進行梯度脫水，之后試驗樣品可放在70%的酒精中保存于-20℃冰箱。開展包埋切片試驗前，將樣品從90%、100%酒精中進行梯度脫水，充分脫水后的組織經二甲苯透明和石蠟包埋，制備成為蠟塊，之后進行石蠟切片，切片厚度為8 μm。經過伊紅蘇木精染色，中性樹脂膠封片，在光學顯微鏡下觀察組織形態特征并拍照。

1.2.2 患病棘胸蛙中病原菌的分離與純化 對患病的棘胸蛙進行解剖，取心、肝、脾、肌肉組織將其研磨，取少許研磨液涂布于固體腦心浸液肉湯培養基中，在28℃恒溫培養48 h，挑取單菌落進行純化并培養，用于后續試驗。

1.2.3 人工感染試驗 將分離到的細菌液體腦心浸液肉湯培養基中，28℃下恒溫振蕩培養24 h，用0.45%的生理鹽水對菌液進行稀釋，取稀釋后的菌液1 mL涂布于健康棘胸蛙的體表進行感染，同時設置無菌生理鹽水對照組，每組健康棘胸蛙數量為5只，每天觀察健康棘胸蛙的生命體征，觀察白內障病征的出現。

1.2.4 病原菌的16S rDNA基因測序鑒定 對導致健康棘胸蛙出現白內障病征的病原菌進行擴大培養后，取1 mL菌液提取DNA，采用16S rDNA基因的通用引物[7]擴增基因片段，將擴增后的PCR產物送到測序公司進行測序。測序結果與NCBI數據庫進行比對分析。

1.2.5 分離菌藥敏試驗 根據KB紙片擴散法[8]，將分離到的致病菌置于腦心浸液液體培養基中，在28℃下震蕩培養24 h，調整菌液濃度，涂布于固體培養基中，將藥敏紙片放入其中，在28℃培養箱中倒置培養48 h，測量抑菌圈大小。

2 結果與分析

2.1 患白內障棘胸蛙組織剖檢觀察

在外觀上，患病的棘胸蛙與正常的棘胸蛙相比，其腹部膨脹（圖1A），四肢腫大（圖1B），眼部異常，其眼角膜呈現乳白色，有“白內障”的特征（圖1C）。解剖后發現病蛙腹腔內部存在大量的積水（圖1D）。對病蛙的各個臟器進行觀察，發現脾臟腫大且呈現黑紫色（圖1E）;肝臟膨大并出現一定量的花斑;心臟與正常的棘胸蛙對比也出現腫大（圖1F）。

2.2 患白內障病棘胸蛙主要臟器的病理學觀察

對患病棘胸蛙的肌肉、肝臟、脾臟和心臟組織進行石蠟包埋切片和伊紅蘇木精（H&E）染色，結果如圖2患病蛙的骨骼肌纖維嚴重變形，部分橫紋消失，部分細胞發生溶解，呈條狀或圓團狀（圖2A）。肝組織壞死嚴重，肝細胞排列松散，腫脹，無具體的細胞形態，甚至部分發生溶解（圖2B）。脾臟出現淤血現象，胞間隙增大，淋巴細胞數量減少（圖2C）。心肌細胞腫脹，細胞溶解或壞死，細胞間的空泡變性，部分肌間隙出現淤血（圖2D）。

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（責任編輯：陳文靜）