患腸炎病海馬的腸道細菌結構特征分析

閆亞楠 陳美玲 吳銳瓊 吳水清 羅輝玉 陳欣欣 何麗斌 鄭樂云 黃鎮

摘 要：腸炎病是海馬人工養殖過程中常見病害，主要是細菌感染而引起的，其傳染性強、危害性高。因此，解析患腸炎病海馬腸道中的細菌菌群組成對于海馬腸炎病的診斷以及防治有著重要意義。采集健康和患腸炎病的膨腹海馬腸道組織，采用細菌16Sr DNA片段高通量測序和生物信息學分析手段，探究患腸炎病海馬的腸道細菌結構特征。結果表明，健康和腸炎病海馬之間的腸道菌群多樣性和結構均存在顯著差異。從屬水平上來看，患病海馬的腸道優勢菌種為弧菌屬Vibrio、漫游球菌屬Vagococcus、分枝桿菌屬Mycobacterium，健康海馬的腸道優勢菌種為玫瑰菌屬Roseibium、擬桿菌目未分類Bacteroidales_unclassified、弧菌屬Vibrio、嗜冷菌屬Psychrobacter，健康海馬和患病海馬中的共有屬包括弧菌屬Vibrio、別弧菌屬Aliivibrio、擬桿菌目未分類Bacteroidetes_unclassified、發光桿菌屬Photobacterium。與健康海馬腸道菌群相比，患病海馬腸道中的弧菌屬Vibrio、別弧屬菌屬Aliivibrio的含量明顯高于健康海馬。此外，腸炎病海馬腸道中分枝桿菌屬Mycobacterium、

β變形菌綱未分類Bacteroidales_unclassified、黃桿菌屬Tenacibaculum和希萬氏菌屬Shewanella為特有的細菌種屬。研究結果解析腸炎病海馬腸道可能的致病菌，對于海馬養殖過程中的病害防治有重要的指導意義。

關鍵詞：海馬;腸炎病;腸道;高通量測序;宏基因組學

中圖分類號：S947.9 文獻標志碼：A 文章編號：0253-2301（2020）12-0001-08

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.12.001

Analysis on the Structural Characteristics of Intestinal Bacteria inHippocampus Infected with Gastroenteritis

YAN Yanan1， CHEN Meiling1， WU Ruiqiong1， WU Shuiqing2， LUO Huiyu2，CHEN Xinxin3， HE Libin2， ZHENG Leyun2*， HUANG Zhen1*

（1. Fujian Key Laboratory of Characteristic Marine Bioresources Sustainable Utilization/College of Life Sciences，

Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China; 2. Fujian Fisheries Research Institute， Xiamen， Fujian 361006，

China; 3. Xiamen Xiaodeng Aquatic Products Technology Co.， Ltd.， Xiamen， Fujian 361000， China）

Abstract： Gastroenteritis is a common disease in the artificial breeding process of Hippocampus， which is mainly caused by bacterial infection， and is highly contagious and harmful. Therefore， it is of great significance to analyze the composition of bacterial community in the intestines of Hippocampus infected with gastroenteritis for the diagnosis and prevention of gastroenteritis. The intestinal structure of healthy and diseased Hippocampus abdominalis were collected， and the highthroughput sequencing of bacterial 16Sr DNA fragments and bioinformatics analysis were used to explore the structural characteristics of intestinal bacteria in the hippocampus infected with gastroenteritis. The results showed that there were significant differences in the intestinal bacterial diversity and structure between the healthy and diseased Hippocampus. At the genus level， the dominant intestinal bacteria of diseased Hippocampus were Vibrio， Vagococcus， and Mycobacterium， while the dominant intestinal bacteria of healthy Hippocampus were Roseibium， Bacteroidales_unclassified， Vibrio， and Psychrobacter. The common genera of the healthy and diseased Hippocampus included Vibrio， Aliivibrio， Bacteroidetes_unclassified， and Photobacterium. Compared with the intestinal flora of healthy Hippocampus， the content of Vibrio and Aliivibrio in the intestines of diseased Hippocampus was significantly higher than that of healthy Hippocampus. Besides， there were some unique bacterial genera in the intestines of diseased Hippocampus， such as Mycobacterium， Bacteroidales_unclassified， Tenacibaculum， and Shewanella. The results of the study analyzed the possible pathogenic bacteria in the intestines of Hippocampus infected with gastroenteritis， which would be of important guiding significance for the prevention and control of diseases in the breeding process of Hippocampus.

Key words： Hippocampus; Gastroenteritis; Intestinal; Highthroughput sequencing; Metagenomics

海馬是海馬屬Hippocampus魚類的通稱，屬于脊索動物門硬骨魚綱、刺魚目、海龍科[1]，廣泛分布于暖溫帶、亞熱帶和熱帶沿岸淺水海域[2]。海馬因其經濟和藥用價值成為世界上交易量最高的海洋生物之一[3]。近幾年來，隨著海洋污染加劇、人類對近岸海域過度開發，以及人類對海馬的過度捕撈，我國沿海的海馬自然資源日益減少，隨著人工養殖海馬技術的突破，養殖規模不斷擴大，人工養殖海馬將成為藥用海馬來源的主要方式。在海馬養殖過程中，由細菌引起的腸炎病是常見的疾病，該病多發于海馬的幼年期，其具體表現癥狀為海馬肛門松弛、紅腫并附有白色物。剖開海馬腹部會發現有大量積液、腸內無食物、腸道發炎充血呈紅色、后腸腫脹明顯、并可能伴有白色結節。病海馬行動癡呆、遲緩漂浮于水面。食欲減退魚體消瘦衰弱致死[4]。

迄今為止，對海馬細菌病的研究大部分采用病原菌分離的研究方法，例如Lin等[5]對患有腸炎的直立海馬進行分離病原菌，得到了1株病原菌DS3，經鑒定DS3為副溶血性弧菌。Wang等[6]對患病線紋海馬的腸道中進行分離病原菌，檢測到1種新型的病原菌強壯弧菌。李營[7]從患表皮潰瘍綜合征線紋海馬的潰爛肌肉及腸道組織中分離病原菌，檢測到副溶血弧菌和哈維氏弧菌。Li等[8]從患病日本海馬的腸道、肝臟和潰爛皮膚中分離出HC2菌株，經鑒定HC2為假單胞菌。Jiang等[9]從患爛尾病的庫達海馬中分離出3種可培養的腸道細菌菌株，經鑒定為假交替單胞菌屬、枯草芽孢桿菌和發光桿菌。Balcázar等[10]從患病長吻海馬和歐洲海馬的有白斑的皮膚和壞死的尾巴中進行病原菌分離，發現溶藻弧菌和燦爛弧菌在患病海馬中占主導地位。Balcázar等[11]從患爛尾病長吻海馬的潰爛皮膚中分離出了

BFLP6T菌株，經鑒定BFLP6T菌株是1種新型的分枝桿菌——海馬分枝桿菌M.hippocampi sp.Nov。這些研究關注的主要是患病海馬的病原菌，但是沒有解析患病海馬自身的腸道微生物狀態。動物腸道中的腸道菌群在宿主中起著“被遺忘”的器官的作用，并為宿主履行其無法自我完成的關鍵功能[12-13]。許多研究表明，腸道菌群是其宿主代謝、免疫力、能量利用和健康維持的重要組成部分

[14-15]。同樣的，海馬的腸道菌群在調節免疫應答、抵抗疾病和抑制潛在病原體方面起著重要作用。當海馬處于健康狀態時，腸道菌群間處于相對穩定的動態平衡中，而這種平衡一旦被打破，致病菌異常增殖，正常菌群的生長受到抑制，宿主就會因腸道菌群的紊亂發生疾病。因此，對養殖過程中腸炎病海馬的腸道菌群進行深入研究有助于全面了解海馬腸炎病的發病機理。

本研究中通過高通量測序技術，對人工養殖的健康和患腸炎病海馬的腸道菌群進行比較分析，解析出健康和患腸炎病海馬腸道中各自特異性的微生物群落結構，為患腸炎病海馬的治療與預防提供理論基礎。1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

健康海馬和患腸道疾病的海馬采集自福建省水產研究所。海馬為膨腹海馬Hippocampus abdominalis，體長10 cm。

1.2 樣品總DNA提取、PCR擴增及高通量測序

將海馬置于解剖鏡下，用酒精對其體表進行消毒，在無菌環境中解剖將腸道取出，同時用無菌海水沖洗3次后放在滅菌的離心管中。5條海馬的腸道混合成1個樣本。在冰上用組織勻漿機將海馬腸道樣品勻漿后，根據說明書用Soil DNA Kit試劑盒（Omega BioTek，USA）提取細菌總DNA。通過在2%的瓊脂糖凝膠中電泳分析總DNA質量和完整性，并使用NanoDrop（ND2000，Thermo Scientific）對DNA濃度進行定量分析。用細菌特異性引物：341F（5′CCTAYGGGRBGCASCAG3′）和806R （5′GGACTACNNGGGTATCTAAT3′） 對16SrDNA基因可變區（V3～V4區）進PCR擴增。PCR產物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行基于Illumina HiSeq測序平臺的高通量測序。

1.3 數據分析

1.3.1 測序數據處理 根據Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數據中拆分出各樣品數據，將Barcode序列和引物序列去除后，利用FLASH v 1.2.7軟件對每個樣品的reads進行拼接、過濾以得到高質量的tags數據， 隨后使用Quantitative Insights Into Microbial Ecology（QIIME 1.9.1）軟件與參考數據庫（Gold database）比對（UCHIME Algorithm）檢驗并去除嵌合體序列，得到有效數據（effective tags）。

1.3.2 OTU聚類和物種注釋 利用Uparse軟件v 7.0.1001對所有樣品的全部有效數據（effective tags）進行聚類，默認以97%的相似性（identity）將序列聚類成為操作分類單元（OTUs）、依據其算法原則，篩選 OTUs 中出現頻數最高的序列作為 OTUs 的代表序列。用Mothur軟件與SILVA的SSUrRNA數據庫對OTUs 的代表序列進行物種注釋分析，每個OTU在結果分析中視作一種細菌。使用MUSCLE v.3.8.31軟件進行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統發生關系。為了去除樣品序列差異引起的誤差，對所有樣品進行均一化處理（以數據量最少的樣品為標準，cutoff=69713），以處理后的數據為基礎進行后續多樣性分析。

1.3.3 樣品復雜度分析 使用QIIME 1.9.1軟件包計算了群落豐富度指數（Chao and Ace）、群落多樣性指數（Shannon and Simpson）、Observedspecies和Goodscoverage，使用R軟件v 3.5.2繪制稀釋曲線并進行Alpha多樣性指數組間差異分析。使用STAMP v.2.1.3進行Metastats分析：通過對組間樣本進行比較，在各分類水平上找出兩組中具有顯著差異的物種。

2 結果與分析

2.1 健康與患病海馬腸道的細菌多樣性指數分析

對于健康與患病海馬腸道提取總細菌DNA后，使用細菌特異性引物進行了PCR擴增，結果如圖1所示。從圖1可見，6個樣品的PCR產物條帶大小正確，并且總量符合測序建庫要求。進一步使用illumina Hiseq進行上機測序，6個樣品得到的數據統計如表1所示。

對6個樣品的測序數據經過OTU比對后，繪制了不同樣品的稀釋曲線，從圖2可以看出，6個樣品的稀釋曲線均隨序列數量的增加而趨于平緩，表明所測的數據量已經可以反映微生物群落結構和多樣性（圖2A）。進一步將6個樣品按照健康與患病海馬分為2組，每組的3個生物學重復樣品，合并進行分析。以97%的相似性對序列進行聚類，相似度大于97%的序列將聚為同一個OTU，健康和患病樣品中有效OTUs數目分別為547、434個，但是健康海馬腸道微生物的ACE、Chao1指數低于患病海馬，表明健康海馬的腸道微生物物種數目低于患病海馬組。健康海馬腸道微生物的Shannon多樣性指數高于患病海馬組，并且Simpson多樣性指數低于患病海馬組，表明在微生物多樣性方面，健康海馬的腸道中微生物的菌群多樣性高于患病海馬（表2）。最后，分別對2種樣品繪制等級分布曲線，結果如圖2B所示，在水平方向上，患病海馬組的曲線在橫軸上的跨度大于健康海馬組，也表明患病海馬組的微生物物種數目高于健康海馬，同時在垂直方向上患病海馬的曲線比健康海馬陡峭，表明患病海馬樣品中存在相對豐度明顯占優的細菌種類。

2.2 健康與患病海馬腸道的細菌群落組成及相對豐度

首先從細菌分類的門水平上通過對健康與患病海馬腸道的細菌群落組成進行比較。本研究確定了4個主要門：變形菌門Proteobacteria（health75.26%、disease 65.6%）、厚壁菌門Firmicutes（health 11.33%、disease 15.98%）、擬桿菌門Bacteroidetes（health 11.05%、disease 9.99%）、放線菌門Actinobacteria（health 11.37%，disease 7.34%）。

其次，在細菌分類的屬水平上，共鑒定出19個主要屬。其中患病海馬的腸道優勢菌種為弧菌屬Vibrio、漫游球菌屬Vagococcus、分枝桿菌屬Mycobacterium、β變形菌綱未分類Betaproteobacteria_unclassified、黃桿菌屬Tenacibaculum、希萬氏菌屬Shewanella。健康海馬中的優勢菌種為玫瑰菌屬Roseibium、擬桿菌目未分類Bacteroidales_unclassified、弧菌屬Vibrio、嗜冷菌屬Psychrobacter、梭菌目未分類Clostridiales_unclassified，紅細菌科未分類Rhodobacteraceae_unclassified。其中弧菌屬Vibrio、弧菌科未分類Vibrionaceae_unclassified、別弧菌屬Aliivibrio、擬桿菌目未分類Bacteroidetes_unclassified、發光桿菌屬Photobacterium為健康海馬和患病海馬中的共有屬。具體的各個屬百分數如圖3所示。

2.3 健康與患病海馬腸道的細菌群落組成差異性分析

為了解析健康與患病海馬腸道的細菌群落組成的差異性，將所有的6個樣品根據OTU的類型進行了主成分分析，結果如圖4所示。從圖4可以看出，所有的6個樣品可以明顯分成2群，一群為健康海馬腸道樣品，另一群為患病海馬腸道樣品，表明2群樣品之間有明顯的差異性。其中健康海馬腸道樣品聚類較為集中，而患病海馬腸道樣品聚類較為分散。

為了進一步解析健康與患病海馬在屬水平上的細菌群落組成的差異性，將兩組樣本利用STAMP進行顯著性差異分析。由圖5可以看出，健康海馬與患病海馬存在明顯差異，在患病海馬中，弧菌屬Vibrio、漫游球菌屬Vagococcus、分枝桿菌屬Mycobacterium、黃桿菌屬Tenacibaculum、希萬氏菌屬Shewanella、β變形菌綱-未分類Betaproteobacteria_unclassified顯著表達。而在健康海馬中玫瑰菌屬Roseibium、嗜冷菌屬Psychrobacter、梭菌目-未分類Clostridiales_unclassified、弓形桿菌屬Arcobacter顯著表達。

3 結論與討論

由于第二代高通量測序技術的數據流量、測序深度和準確性都很高，所以目前該技術在水產養殖相關的研究應用廣泛，其中在魚類腸道菌群的研究應用尤為廣泛[16]。最近的研究發現，腸道微生物多樣性的變化和腸道菌群失衡對寄主魚類有不同的影響[17-18]。本研究通過基于16Sr DNA的高通量測序技術分析了健康和患腸炎病海馬腸道菌群結構差異，這將有助于對于腸炎病海馬的治療以及為海馬的健康養殖提供理論基礎。

在本研究中，海馬腸道菌群中的優勢菌群是變形菌門Proteobacteria、厚壁菌門Firmicutes、擬桿菌門Bacteroidetes。另外，在屬水平上，本研究在患病和健康海馬的腸道中均鑒定出嚴重的一些潛在病原體：弧菌屬、別弧菌屬、發光桿菌屬，其中弧菌屬在患病的海馬腸道中的含量明顯高于健康海馬。弧菌屬細菌是海洋環境中分布最廣泛細菌類群之一，大部分弧菌屬是海洋環境及某些海洋動物中正常菌群的組成部分，但也有部分弧菌會對水產養殖造成巨大危害[19]。比如Lin等[5]、Sao等[20]和Qin等[21]分別對副溶血弧菌、塔氏弧菌和哈維氏弧菌在海馬腸道中的作用進行鑒定，結果表明弧菌屬的豐度提高可能會導致海馬消化不良和食欲不振，使其變得瘦弱，容易受到機會病原體的侵害。此外，在患病海馬中還發現了機會致病菌：分枝桿菌屬、黃桿菌屬。分枝桿菌在淡水魚類和海水魚類均存在，魚類感染分枝桿菌后會在內臟中形成許多灰白色或淡黃色小結節，分枝桿菌病可以分為慢性感染和急性感染，慢性感染會引起魚類零星死亡但急性感染有可能引起魚類大量死亡[22]。黃桿菌對淡水魚類、海洋魚類、兩棲動物、其他水生動物以及海洋微藻都有致病作用，死亡率可高達100%[17]。因此，弧菌屬、分枝桿菌屬、黃桿菌屬的存在可能會誘發海馬發病。進一步通過matastats分析，得出健康海馬中存在著幾個差異顯著的菌屬：嗜冷菌屬Psychrobacter、梭菌目-未分類Clostridiales_unclassified、弓形桿菌屬Arcobacter。其中已有報道證明，梭菌和嗜冷菌是健康細鱗魚和黑斑狗魚中的優勢菌群[18]。梭菌也是養殖條件下健康大黃魚腸道中的優勢菌群[23]。弓形桿菌存在于海水、沿海沉積物以及海洋無脊椎動物中[24]，Romero等[25]發現人工養殖的健康智利牡蠣中廣泛存在弓形桿菌，此外，在人工養殖的健康歐洲龍蝦、鮑魚中也發現了弓形桿菌[26-27]。上述研究結果與已有報道的結果一致，比如Ma等[16]研究發現，患病云龍石斑魚和健康云龍石斑魚之間腸道菌群的豐富度和多樣性沒有顯著差異，但患病魚中主要的菌群（如變形桿菌）的含量上調。Wang等[28]研究發現，健康和患病養殖大西洋鮭的腸道菌群有所不同，在健康的魚類腸道中觀察到的細菌多樣性明顯高于發病魚類，在患病魚類腸道中，一些機會性病原體明顯豐富，而健康魚類腸道中含有更多的益生菌。

總之，為了解析腸炎病海馬腸道中的細菌菌群組成，通過高通量測序比較健康和患病海馬之間的腸道細菌組成。結果表明，當海馬患病時，主要細菌的豐度發生了顯著變化，在患病海馬中，擬桿菌和紅細菌明顯減少，而弧菌則被上調。在屬水平上，在患病的海馬中一些病原細菌，如弧菌、別弧菌屬明顯增加;并且僅在患病海馬中檢出了黃桿菌、分枝桿菌和希萬氏菌，這些菌群可能是引起海馬患病的重要潛在病原體。本研究結果表明，微生物群結構的改變可能與腸道炎癥的發作同時發生，這為了解腸道微生物群與疾病的發生之間的聯系提供了幫助。同時本研究的結果對海馬的養殖以及對海馬腸道微生物群生態學的理解具有重要意義。

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