過氧化物酶體增殖物激活受體γ激動劑對食管鱗癌化療敏感性影響的研究

吳 愷，何宏博，張 澎，曾 誠，劉東雷，趙 松

(鄭州大學第一附屬醫院胸外科，河南 鄭州 450052)

據2018年全球癌癥統計報道，在世界范圍內食管癌發病率高居惡性腫瘤第7位，死亡率高居第6位[1]。其中食管鱗癌是食管癌的主要病理類型[2]。目前，以順鉑為基礎的聯合化療仍是食管鱗癌患者最為常見的化療方案，但對順鉑化療的不敏感是食管鱗癌患者治療失敗的主要原因，嚴重威脅患者的生命健康，影響預后[3-4]。因此，提高食管鱗癌的順鉑化療敏感性，可提高提高食管鱗癌的臨床治療效果，改善預后。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ (peroxisome proliferator activated receptor γ，PPAR-γ)是Ⅱ型核激素受體超家族的一類由配體激活的核轉錄因子[5]。通常與視黃素X受體形成異二聚體并招募共抑制蛋白復合物與之結合，進而抑制靶基因的轉錄；此外，也可與配體結合激活，釋放共抑制蛋白并結合輔激活蛋白，與所調節基因的啟動子上游因子結合從而對靶基因的轉錄進行調控，發揮生物學功能[6]。研究[7]報道，PPAR-γ可通過調控脂肪和糖代謝、能量平衡、炎癥反應等抗肝纖維化、抗動脈粥樣硬化、改善心衰、抗腫瘤等。

據研究[8]報道，在多種腫瘤細胞中均存在PPAR-γ的表達，經配體激活后，PPAR-γ可抑制結腸癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等多種腫瘤細胞的生長。有研究[9]報道PPAR-γ在食管癌和肺癌中的表達顯著降低，經配體激活后可通過多種途徑誘導腫瘤細胞凋亡。此外，還有研究[10-11]發現PPAR-γ激動劑可顯著增強5-Fu對人結腸癌化療的敏感性。這些研究結果均提示PPAR-γ在不同腫瘤中的功能具有多樣性。但目前有關PPAR-γ在食管鱗癌化療敏感性中的作用仍無報道。基于此，闡明PPAR-γ在順鉑耐藥的食管鱗癌中的生物特性、對順鉑化療敏感性的影響，可為其作為靶點應用于食管鱗癌的綜合治療奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑食管鱗癌EC109細胞購自上海生物科學院細胞庫；順鉑、羅格列酮購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；MTT試劑盒均購自美國Thermo公司；DMEM高糖培養基購自美國Gibco公司。

1.2 細胞系及培養采用體積分數10%胎牛血清、質量分數1%雙抗(青霉素/鏈霉素)的RPMI-1640完全培養基培養EC109細胞，在37 ℃恒溫、體積分數5% CO2培養箱中培養，取對數期狀態良好的細胞用于實驗。

1.3 MTT法檢測細胞增殖取生長良好的處于對數期的EC109細胞接種于96孔細胞培養板中，每孔100 μL(約1×104個細胞)。另設對照組、羅格列酮組(5、10、20、40 μmol/L)、順鉑組(10 μmol/L)、羅格列酮聯用順鉑組，分別于24、48、72 h后收集細胞，每孔加入15 μL MTT溶液[用磷酸鹽緩沖液(PBS)配成5 g/L]避光培養4 h，棄去96孔板中培養基，每孔加150 μL二甲亞砜，振蕩10 min，37 ℃環境中放置30 min，酶標儀測定570 nm處每孔吸光度值。計算細胞存活率，實驗重復3次。

1.4 細胞周期分布檢測細胞經處理48 h后，收集細胞并用PBS洗滌1次，沉淀用預冷的體積分數70%乙醇固定過夜。離心去除固定液并用PBS洗滌1次，調整細胞密度為1×106個/mL，加入核糖核酸酶(0.25 g/L)，37 ℃水浴30 min，加入碘化丙啶染色液至終濃度為20 mg/L，室溫避光染色10 min，用流式細胞儀檢測細胞周期變化。

1.5 荷瘤裸小鼠模型的建立及分組BALB/c，nu/nu裸小鼠，雌性，4～5周齡，體質量18～20 g，購自北京維通利華有限公司，SPF級條件下進行適應性飼養1周。將處于對數生長期的EC109細胞經胰蛋白酶消化后，離心去上清洗滌，再用培養基洗滌，制備成細胞懸液(1×107個/mL)，于裸小鼠后背右側皮下進行腫瘤細胞接種(200 μL，2×105個細胞)。

接種完食管鱗癌細胞約12 d后即可形成腫瘤。將24只EC109細胞移植瘤荷瘤裸小鼠隨機分為4組：對照組、羅格列酮組(3 mg/kg)、順鉑組(6 mg/kg)、羅格列酮(3 mg/kg)聯合順鉑(6 mg/kg)組。采用灌胃給藥，連續每天給藥2周，給藥量約0.2 mL，對照組給予相同體積的生理鹽水。

1.6 荷瘤裸小鼠腫瘤結節生長的測定分別于治療后的第0、4、8、12和16天精密測量腫瘤結節的最長徑(a)和最短徑(b)，根據公式計算腫瘤體積V=1/6 π(ab2)，取得均值繪制腫瘤生長曲線。于第18天處死裸鼠，精密稱量腫瘤質量，計算腫瘤生長抑制率。腫瘤生長抑制率=(對照組腫瘤平均瘤質量-實驗組腫瘤平均瘤質量)/對照組腫瘤平均瘤質量×100%。

2 結果

2.1 羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯合順鉑對EC109細胞的抑制作用羅格列酮可顯著增強順鉑對EC109細胞的抑制作用，并呈現時間和劑量依賴性。見圖1。

圖1 羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯合順鉑對EC109細胞的抑制作用

2.2 羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯合順鉑對EC109細胞細胞周期的影響細胞周期分布分析結果顯示羅格列酮聯合順鉑使EC109細胞S期細胞顯著增多。見表1。

表1 羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯合順鉑對EC109細胞細胞周期的影響 %

2.3 羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯合順鉑對EC109細胞移植瘤荷瘤裸小鼠腫瘤的影響羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯合順鉑對EC109細胞裸鼠移植瘤的抑制率分別為40.21%、52.84%、75.22%。羅格列酮聯合順鉑組小鼠腫瘤體積顯著減小。見圖2、表2。

表2 羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯合順鉑對EC109細胞移植瘤荷瘤裸小鼠腫瘤質量和生長抑制率的影響

圖2 羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯合順鉑對EC109細胞移植瘤荷瘤裸小鼠腫瘤生長曲線的影響

3 討論

化療是食管癌的重要基礎治療手段，順鉑目前是臨床治療食管鱗癌的常規一線化療藥物[2]。但許多患者在應用以順鉑為基礎的傳統化療方案后對順鉑不敏感，復發率高，易產生耐藥性，進一步造成食管鱗癌患者的化療失敗和死亡[3]。研究[4]報道，食管癌患者對順鉑的不敏感是一個多因素、多機制參與的復雜過程，主要與多藥耐藥轉運蛋白、微管蛋白、熱休克蛋白等密切相關。但食管鱗癌耐藥的機制仍未完全闡釋清楚。而將不同作用機制的化療藥物聯合應用可能能提高食管鱗癌的化療效果，增加其對順鉑的敏感性。

PPAR-γ作為PPARs家族的一種核轉錄因子，與相應配體結合后可誘導或抑制靶基因的表達[12]。據研究[13]報道，在結腸癌、乳腺癌、肺癌及多種消化道腫瘤中PPAR-γ均有表達。PPAR-γ可通過阻滯細胞周期、誘導腫瘤細胞分化或凋亡等抑制其生長。Liang等[14]研究報道乳腺癌患者中，高表達PPAR-γ者疾病無進展生存期更長。而在非小細胞肺癌細胞系中，PPAR-γ活化可致腫瘤細胞分化并誘導其凋亡[15]。此外，Ogino等[16]報道PPAR-γ的表達水平與結腸癌患者的臨床預后呈正相關，PPAR-γ可作為結腸癌治療效果的靶點。上述研究提示，PPAR-γ下調可能為腫瘤細胞耐藥的機制之一。但PPAR-γ在食管癌化療敏感性中的作用報道極少。

本研究分別從細胞水平、動物水平探討過PPAR-γ激動劑羅格列酮對食管癌化療敏感性的影響。結果表明：羅格列酮可顯著增強順鉑對EC109細胞的抑制作用，并呈現時間和劑量依賴性。細胞周期分布分析結果顯示羅格列酮聯合順鉑可使EC109細胞S期細胞顯著增多。羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯合順鉑對EC109細胞裸鼠移植瘤的抑制率分別為40.21%、52.84%、75.22%羅格列酮聯合順鉑組小鼠腫瘤體積顯著減小。以上結果表明羅格列酮聯合順鉑可顯著提高食管癌化療敏感性。

綜上所述，PPAR-γ激動劑羅格列酮能夠顯著增強順鉑對食管癌的化療敏感性，其機制主要與S期細胞周期阻滯有關。本研究結果可為提高食管癌的臨床治療效果奠定理論和實驗基礎。