雷珠單抗或加減駐景方對形覺剝奪性近視豚鼠眼軸和脈絡膜厚度的短期影響

劉俐娜，鐘興武，劉紅山，王丹陽，徐家窈，勞 偉，吳挺飛

0引言

隨著對脈絡膜厚度研究的逐漸深入，大量研究發現脈絡膜厚度隨著近視度數的增加而變薄[1-2]，因此脈絡膜厚度的變化在青少年近視的防控中起著十分重要的作用。血管內皮生長因子(VEGF)是二聚體糖蛋白，其負責新生血管的形成和脈絡膜毛細血管的通透性，當與血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)結合后可通過調控血管通透性來影響血流灌注率[3]，由于脈絡膜厚度取決于其灌注率，抗VEGF藥物可能通過與VEGF結合，使VEGF失去活性，從而改變毛細血管通透性、改變血流灌注率，并通過影響脈絡膜血流量和脈絡膜腔隙的大小來改變脈絡膜的厚度。本研究通過制作形覺剝奪性近視豚鼠動物模型，觀察加減駐景方和雷珠單抗注射液對豚鼠形覺剝奪恢復期的屈光度、眼軸長度和脈絡膜厚度的短期變化，探討兩種藥物對形覺剝奪性近視恢復期的影響。

1材料和方法

1.1材料選取2周齡健康英國種三色短毛豚鼠60只(長沙市天勤生物技術有限公司)，體質量120g左右，入組前對各組豚鼠眼部進行篩查，排除白內障、先天性近視、角膜疾病等常見眼部疾病，測量各組豚鼠眼球屈光度及眼軸長度，各組實驗前屈光度及眼軸長度差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1、2。飼養溫度保持25℃左右，控制12h/12h的晝夜規律，自由飲食。本研究程序遵循實驗程序依照《實驗動物管理與使用指南》，本研究方案經海南省眼科醫院動物倫理委員會審查批準(2017-003)。

加減駐景方顆粒劑：由枸杞子、楮實子、菟絲子、五味子、茺蔚子、三七等組成，由四川新綠色藥業科技發展股份有限公司提供；雷珠單抗眼用注射液：由諾華制藥公司(瑞士)提供(進口藥品注冊證號：S20160002，產品批號：SDY07)。

1.2方法

1.2.1動物模型制作和分組60只2周齡豚鼠連續配戴右眼遮蓋的頭罩2wk。無毒半透明小號乳膠氣球，按照豚鼠頭部大小形狀剪成頭套，充分露出豚鼠的左眼、口鼻及雙耳。2wk后分別測量各組的屈光度及眼軸長度，觀察近視造模情況。將4周齡豚鼠去除右眼遮蓋頭罩，隨機分為駐景方組、雷珠單抗組和生理鹽水組各20只，駐景方組行加減駐景方灌胃3.285g/(kg·d)(1.5mL/d)，生理鹽水組予生理鹽水灌胃1.5mL/d，共7d，雷珠單抗組第1d右眼玻璃體腔注射雷珠單抗注射液0.02mg 1次。4周齡豚鼠在給藥前和給藥后1、3d，1wk上午8∶00～12∶00通過A超測量右眼眼軸長度和OCT測量脈絡膜厚度。

1.2.2雷珠單抗注射液玻璃體內注射提前1d使用妥布霉素滴眼液(愛爾康公司，美國)滴右眼(每日6次)，術前用復方托吡卡胺滴眼液(參天制藥有限公司，日本)散瞳，50g/L水合氯醛腹腔注射麻醉，眼周用碘伏消毒完畢后鋪無菌洞巾，聚維酮碘滴眼液消毒結膜囊及眼表，1min后用氯化鈉注射液沖洗干凈。在顯微鏡下用顯微鏡有齒鑷固定眼球，微量注射器在顳側角膜緣后1mm處垂直鞏膜進針，針頭向眼球壁傾斜20°避開晶狀體推進約3mm后注射雷珠單抗，注射完畢后用齒鑷輕輕夾住針孔30s，妥布霉素眼膏(愛爾康公司，美國)涂眼，無菌紗布遮蓋包扎，術后第2d抗生素滴眼液滴右眼(每天6次)。

1.2.3測量屈光度右眼使用睫狀肌麻痹劑10g/L鹽酸環噴脫酯滴眼液(愛爾康公司，美國)，每5min滴1次，共4次，30min后進行帶狀光檢影驗光(YZ24型，中國蘇州六六公司)，由驗光經驗豐富的檢查者檢影，以等效球鏡(球鏡度+1/2柱鏡度)進行數據分析。

1.2.4測量眼軸長度應用AVISO眼科A超測量儀(光太公司，法國)，測量前先用10g/L鹽酸丙美卡因滴眼液(美國愛爾康公司)行角膜表面麻醉。測量時探頭對準角膜中心并垂直于角膜平面，測定右眼眼軸長度手動模式連續測量5次，計算平均值，精確到0.01mm。

1.2.5測量脈絡膜厚度豚鼠處于自然清醒狀態，撐開右眼眼瞼，固定于OCT(SpectralisHRA+OCT，海德堡公司，德國)頜架合適位置，通過監視屏觀察，按照設備使用方法對豚鼠眼球后極部進行掃描，選擇870nm的波長，增強的深度成像模式(EDI)，模式大小為30°×15°，沿水平和垂直掃描視盤，中心與視盤中心相連。該脈絡膜定義為從外表面延伸視網膜色素上皮到鞏膜內表面，測量距離視盤1mm處的顳側脈絡膜厚度(圖1)。豚鼠OCT掃描過程均由兩位醫師在OCT檢查室內進行操作完成，一名醫師負責保持豚鼠眼睛位置，同時協助調整被檢眼距離OCT掃描鏡頭的距離，以使監視器可以清晰看到視盤；另一名醫師負責進行OCT操作。重復檢測3次以上，取平均值。

2結果

2.1三組屈光度比較三組給藥前后不同時間點的屈光度比較，差異有統計學意義(F組別=5.873，P組別=0.006；F時間=6.047，P時間=0.003)，且時間因素和分組因素存在交互作用，差異有統計學意義(F交互作用=14.45，P交互作用<0.01)。雷珠單抗組給藥前后的屈光度比較差異無統計學意義(P>0.05)，駐景方組和生理鹽水組給藥后1、3d的屈光度明顯降低(P<0.05)，但在1wk時恢復到給藥前的水平(P>0.05)，且3d時的屈光度低于1d(P<0.05)。給藥1d時生理鹽水組和駐景方組低于雷珠單抗組(P<0.05)，駐景方組和生理鹽水組比較差異無統計學意義(P>0.05)。給藥3d時生理鹽水組低于駐景方組和雷珠單抗組，且駐景方組低于雷珠單抗組，差異均有統計學意義(P<0.05)。給藥前及給藥1wk時三組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2三組眼軸長度比較三組給藥前后不同時間點的眼軸長度比較，差異有統計學意義(F組別=10.876，P組別=0.001；F時間=7.110，P時間=0.003)，并且時間因素和分組因素存在交互作用，差異有統計學意義(F交互作用=8.765，P交互作用<0.01)。雷珠單抗組給藥前后的眼軸長度比較差異無統計學意義(P>0.05)，駐景方組和生理鹽水組給藥后1、3d的眼軸長度明顯縮短(P<0.05)，但在1wk時恢復到給藥前的水平(P>0.05)，且3d時的眼軸長度短于1d(P<0.05)。給藥1d時生理鹽水組和駐景方組的眼軸長度短于雷珠單抗組(P<0.05)，駐景方組和生理鹽水組比較差異無統計學意義(P>0.05)。給藥3d時生理鹽水組的眼軸長度短于駐景方組和雷珠單抗組(P<0.05)，且駐景方組短于雷珠單抗組(P<0.05)。給藥前及給藥1wk時三組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

圖1 測量距離視盤1mm處的顳側脈絡膜厚度。

組別給藥前給藥1d給藥3d給藥1wk雷珠單抗組-7.45±1.41-7.48±1.53-7.51±2.42-7.49±1.85駐景方組-7.46±1.62-6.84±1.71a,c -5.61±1.73a,c-7.63±1.94生理鹽水組-7.46±1.32-6.63±1.95a,c-3.79±2.11a,c -7.94±2.16

注：aP<0.05vs組內給藥前；cP<0.05vs同時間雷珠單抗組。

組別給藥前給藥1d給藥3d給藥1wk雷珠單抗組8.11±0.138.11±0.238.13±0.198.14±0.15駐景方組8.12±0.147.93±0.16a,c7.69±0.24a,c8.12±0.17生理鹽水組8.12±0.177.85±0.22a,c7.06±0.18a,c8.18±0.136

注：aP<0.05vs組內給藥前；cP<0.05vs同時間雷珠單抗組。

組別給藥前給藥1d給藥3d給藥1wk雷珠單抗組86.12±8.2590.36±6.4789.58±6.6384.33±10.45駐景方組85.25±9.01110.44±8.57a,c124.28±8.92a,c87.01±8.15生理鹽水組86.17±8.43112.62±9.23a,c196.18±10.41a,c90.64±8.42

注：aP<0.05vs組內給藥前；cP<0.05vs同時間雷珠單抗組。

2.3三組脈絡膜厚度比較三組給藥前后不同時間點的脈絡膜厚度比較，差異有統計學意義(F組別=16.243，P組別<0.01；F時間=8.332，P時間=0.001)，并且時間因素和分組因素存在交互作用，差異有統計學意義(F交互作用=7.766，P交互作用<0.01)。雷珠單抗組給藥前后的脈絡膜厚度比較差異無統計學意義(P>0.05)。駐景方組和生理鹽水組給藥后1、3d的脈絡膜厚度明顯變厚(P<0.05)，但在1wk時恢復到給藥前的水平(P>0.05)，且3d時的脈絡膜厚度較1d時更厚(P<0.05)。給藥1d時生理鹽水組和駐景方組的脈絡膜厚度厚于雷珠單抗組(P<0.05)，駐景方組和生理鹽水組比較差異無統計學意義(P>0.05)。給藥3d時生理鹽水組的脈絡膜厚度厚于駐景方組和雷珠單抗組(P<0.05)，且駐景方組厚于雷珠單抗組(P<0.05)。給藥前及給藥1wk時三組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

3討論

豚鼠屬于哺乳動物，眼球結構和功能接近于人類，有著和人類相似的正視化機制，以及與人類相似的形覺剝奪性近視生長曲線。眼球正視化過程受到光照、飲食習慣和遺傳等因素的影響，這個過程出現差錯時將會導致屈光不正或者其他眼病[4-5]。

有研究[6]發現小雞的脈絡膜厚度的變化與近視相關，這是近視動物研究的一項重大發現。脈絡膜可通過自身厚度的改變使光學平面前后移動，從而引起眼屈光度的改變，當配戴正鏡片時，視網膜成像產生近視離焦，小雞的眼脈絡膜厚度顯著增加，使視網膜前移接近成像焦點;而誘發近視時，視網膜成像產生遠視離焦，脈絡膜厚度會變薄。同時，脈絡膜還會將視網膜感應到的離焦信息傳遞給鞏膜，進而阻止或加速眼軸的增長[7]。因此，脈絡膜厚度的改變在屈光不正的發生發展中起到至關重要的作用。已在小雞等實驗動物和人類身上發現[4, 8-9]。

迄今為止，大量文獻研究發現在形覺剝奪性近視和恢復的過程中，隨著脈絡膜血管滲透性的雙向變化，脈絡膜的厚度也產生了相應的變化。有研究[10]發現，在人類形覺剝奪性近視恢復期，脈絡膜增厚，脈絡膜上腔液中蛋白含量增加;而形覺剝奪性近視進展期，脈絡膜變薄，上腔液中蛋白含量下降，這與我們實驗中對照組豚鼠的脈絡膜厚度在形覺剝奪性近視恢復期出現短暫的脈絡膜增厚的變化是一致的，可能與毛細血管通透性改變導致蛋白質移至細胞外基質或淋巴管有關。還有相應的研究[11-12]發現，脈絡膜血管直徑引起的血流量變化也會導致脈絡膜厚度發生變化。Wallman等提出動物實驗中近視離焦后的脈絡膜厚度增加主要通過脈絡膜血流的變化和脈絡膜腔隙的擴張而產生[6]。Nickla等[13]也發現，在離焦性近視中，毛細血管通透性增加而導致的血流量增加可能會導致脈絡膜增厚。

由此我們推測，抗VEGF藥物可通過與VEGF-A結合，使VEGF-A失去活性，改變毛細血管通透性，減少血流灌注率從而減少脈絡膜血流量和脈絡膜腔隙的大小來抑制形覺剝奪恢復期脈絡膜厚度的增厚，Mathis等[14]研究發現，玻璃體腔內注射了貝伐珠單抗注射液的小雞在形覺剝奪性近視恢復期的脈絡膜厚度增厚被抑制，且持續了1wk的時間，而且脈絡膜中VEGF因子顯著減少，這也證實了抗VEGF藥物可以通過與VEGF-A結合來抑制脈絡膜厚度的增厚。雷珠單抗是一種能有效抗人眼VEGF的抗體并已廣泛應用于臨床，我們的實驗中發現玻璃體腔內注射了雷珠單抗注射液的豚鼠在形覺剝奪性近視恢復期的脈絡膜厚度增厚同樣在1wk的時間內得到了抑制，也有研究[15]以《中醫眼科六經法要》[16]中駐景方形成固定方劑，發現其可以減少脈絡膜新生血管中VEGF的表達，我們在研究中也發現兩種藥物均對脈絡膜厚度的變化產生了相應的影響,抑制了脈絡膜的增厚，眼軸的縮短以及屈光度的減少，但是雷珠單抗的影響要明顯得多，全程均明顯抑制了形覺剝奪性近視恢復期脈絡膜的增厚，而駐景方在3d時才開始出現輕微的增厚抑制，但均只持續了短暫的1wk時間。這種變化既可能是因為雷珠單抗的抗VEGF作用很顯著，通過與VEGF-A結合，改變了毛細血管通透性導致蛋白質移至細胞外基質或淋巴管，血流灌注率減少從而減少脈絡膜血流量和脈絡膜腔隙的大小，也不排除由于豚鼠形覺剝奪恢復期的脈絡膜增厚僅表現為短暫的1wk時間，中藥駐景方由于服用時間較短作用尚未充分顯現，本實驗1wk的研究時間較短，有一定的局限性，但雷珠單抗注射液對豚鼠形覺剝奪性近視的脈絡膜厚度有明顯的干預效果，這可作為青少年近視防控研究的一個著陸點，進一步深入研究。

綜上所述，雷珠單抗注射液玻璃體腔注射全程抑制了豚鼠形覺剝奪性近視恢復期的脈絡膜增厚，同時也抑制了眼軸的縮短和近視度數的恢復，而中藥駐景方在3d時才出現了輕微的脈絡膜增厚抑制，且均只持續了短暫的1wk時間。這可能與抗VEGF藥物通過與VEGF-A因子結合，能夠減少血流灌注率，降低脈絡膜血流量，抑制脈絡膜增厚有關。