NF-κBIA基因多態性與新生兒細菌性腦膜炎易感性相關性分析

李文娟 梅家平 楊勇

[摘要] 目的 探究NF-κBIA基因多態性與新生兒細菌性腦膜炎易感性的關系。 方法 選取2016年3月～2019年3月南方醫科大學附屬深圳婦幼保健院新生兒科收治的新生兒211例，其中新生兒腦膜炎患者67例為病例組，正常新生兒69名為對照組，非腦膜炎炎性發熱新生兒75例為發熱組。采用Sanger法測序，通過PCR擴增，對NF-κBIA基因的2個SNP位點（rs3138053、rs2233406）進行基因分型。觀察NF-κBIA基因多態性與新生兒細菌性腦膜炎的易感相關性。 結果 三組新生兒rs3138053、rs2233406位點的期望值和觀察值吻合度良好，均符合哈迪溫伯格平衡（P > 0.05）。rs3138053位點的基因型頻率與新生兒細菌型腦膜炎易感性存在相關性（P < 0.05）。 結論 NF-κBIA基因多態性與新生兒細菌性腦膜炎易感性相關。

[關鍵詞] 新生兒細菌性腦膜炎;NF-κBIA基因;單核苷酸多態性;基因型

[中圖分類號] R742.6? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）02（c）-0019-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between NF-κBIA gene polymorphism and neonatal bacterial meningitis susceptibility. Methods From March 2016 to March 2019， 211 cases admitted to the Department of Neonatology， Affiliated Shenzhen Maternity & Child Healthcare Hospital， Southern Medical University. Among them， 67 cases of neonatal meningitis were in the case group， 69 normal neonates were in the control group， and 75 cases with non-meningitis inflammatory febrile neonates were in the fever group. Two SNP sites （rs3138053 and rs2233406） of NF-κBIA gene were genotyped by PCR amplification using Sanger sequencing. The genotype sequencing results of different sites and the susceptibility analysis of neonates bacterial meningitis were observed. Results rs3138053 and rs2233406 were in good agreement with the expected value and the observed value in three groups， which were consistent with Hardy-Weinberg equilibrium （P > 0.05）. rs3138053 was correlated with the susceptibility of neonatal bacterial meningitis （P < 0.05）. Conclusion NF-κBIA gene polymorphism is associated with susceptibility to neonatal bacterial meningitis.

[Key words] Neonatal bacterial meningitis; NF-κBIA gene; Single nucleotide polymorphism; Genotype

新生兒腦膜炎是一種以感染引起的腦膜炎癥為特征的疾病，通常發生在生命的前28 d。新生兒細菌性腦膜炎（neonatal bacterial meningitis，NBM）的發病率為（0.25～1）/1000活產嬰兒，其中大約25%的新生兒患有菌血癥[1]，其病死率和后遺癥發生率高[2]。核因子-κB（NF-κB）是新近研究發現的一組經典炎癥信號通路中與炎性反應相關的基因，研究發現NF-κB基因的表達與細菌性腦膜炎的發生關系密切， 由NF-κBIA編碼的IkBa是NF-κB活性的重要抑制劑[3-4]。單核苷酸多態性（SNP）是人類遺傳學變異中最常見的一種。目前尚沒有NF-κBIA基因多態性與新生兒細菌性腦膜炎相關研究，本研究旨在探討新生兒NF-κBIA基因多態性與新生兒細菌性腦膜炎易感性的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用病例-對照研究方法，收集2016年3月～2019年3月南方醫科大學附屬深圳婦幼保健院（以下簡稱“我院”）新生兒科住院的足月新生兒，其中腦膜炎新生兒67例為病例組，正常新生兒69名為對照組，非腦膜炎炎性發熱[5]新生兒75例為發熱組。對照組，男27例，女42例;孕齡37～41周，平均（39.1±1.2）周;出生體重2900～3900 g，平均（3333.2±437.9）g。發熱組，男32例，女43例;孕齡37～41周，平均（38.8±1.6）周;出生體重2900～3900 g，平均（3324.3±547.1）g。病例組男26例，女41例;孕齡37～41周，平均（38.7±1.6）周;出生體重2900～3900 g，平均（3243.5±678.1）g。三組一般資料比較，差異無統計學差異（P > 0.05），具有可比性。本研究經我院醫學倫理委員會批準，參與研究患兒家屬均簽署知情同意。

納入標準：符合第5版《實用新生兒學》[6]新生兒細菌性腦膜炎的診斷標準，患兒納入病例組。因“發熱”入院，經檢查為細菌性炎癥但非腦膜炎的患兒納入發熱組。因各種原因（包括家長因素）入院，經臨床及實驗室檢查無病理情況的患兒納入正常組。排除標準：①新生兒窒息或缺血缺氧性腦病等神經系統疾病;②遺傳代謝性疾病者;③免疫缺陷病者;④內分泌系統疾病者;⑤先天性心臟病。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及模板DNA提取? 采取受試者靜脈血1 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，全血基因組DNA提取試劑盒[上海生工生物科技有限公司（以下簡稱“生工生物”），批號：B518253]抽提DNA。

1.2.2 SNP位點的選取? 根據NCBI網站Genebank數據庫已公布的NF-κBIA基因序列，選取2個已知炎癥相關的SNP位點即rs3138053、rs2233406。

1.2.3 引物設計與合成? 采用primer 5.0軟件結合文獻進行引物設計。聚合酶鏈式反應（PCR）引物設計完成后，交由生工生物合成引物。PCR引物及擴增片段長度見表1。

表1? ?PCR引物及擴增片段長度

1.2.4 PCR? 以cDNA為模板，使用熒光定量試劑盒（美國ABCAM公司，批號：ab460332）進行實時熒光定量PCR反應;PCR產物純化回收試劑盒（生工生物，批號：B518141）回收PCR產物。構成20 μL標準反應體系，特定條件下上機電泳，result group中尋找結果，并用sequence analysis軟件進行分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0統計學軟件及Haploview 4.2軟件進行數據分析，基因型頻率采用基因計數法計算，等位基因頻率分布用百分率（%）表示，組間頻率比較采用χ2檢驗;以P < 0.05為差異有統計學意義。利用哈迪-溫伯格遺傳平衡定律檢驗病例組、發熱組及對照組是否具有群體代表性，P > 0.05為基因型頻的總體分布符合平衡定律。

2 結果

2.1 DNA提取及NF-κBIA基因引物電泳結果

結果顯示DNA完整無降解，見圖1。NF-κBIA基因的2個SNP位點表達顯著，見圖2。

2.2 基因型測序結果

rs3138053位點基因型測序結果為AG、AA、GG;rs2233406位點基因型測序結果為CT、CC、TT。見圖3～4。

2.3 哈迪-溫伯格平衡檢驗結果

2個SNP位點在病例組、發熱組及對照組中的觀察值和期望值吻合度良好，均符合哈迪-溫伯格平衡定律（P > 0.05）。見表2。

2.4 基因型頻率分布比較結果

rs3138053位點中三組基因型頻率比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。rs2233406位點中三組基因型比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表3。

3 討論

新生兒細菌性腦膜炎發病率日益升高，是導致新生兒出現后遺癥或死亡的主要疾病之一[7]。NF-κB定位于染色體4q24區域，NF-κB1基因是一種編碼了105 kD大小的蛋白，參與調節機體炎性反應、免疫應答、氧化應激以及細胞凋亡等多種生理和病理過程[8-10]。

NF-κB通路的激活是細菌性腦膜炎發生的重要特征之一，其在介導大腸桿菌K1菌株（E. coli K1）侵襲人腦微血管內皮細胞及多核中性粒細胞遷移穿過血腦屏障中發揮了重要作用[11-12]，NF-κB信號通路激活，促進中性粒細胞中MRP8/14的釋放，增強肺炎球菌性腦膜炎小鼠炎性反應[13]。在細菌性腦膜炎小鼠模型中，攜帶NF-κB1 ATTG1/ATTG1多態性位點的小鼠，其神經炎癥和神經細胞凋亡減少[14]，并藉此抑制E. coli K1的侵襲和中性粒細胞遷移。NF-κB調節實驗性肺炎鏈球菌腦膜炎中的腦源性神經營養因子（BDNF），可能為肺炎鏈球菌腦膜炎提供潛在的治療靶點[15]。Western blot結果顯示，細菌性腦膜炎患者集落刺激因子NF-κB基因多態性SNP位點rs2233406活性高于無菌性腦膜炎患者，在癌性腦膜炎中幾乎不被激活[16]。腦膜炎患者腦脊液（CSF）細胞中NF-κB活化傾向于與白細胞介素-6濃度相關[17-19]。NF-κB基因及其單核苷酸多態性位點的攜帶在細菌性腦膜炎疾病發生及演變中發揮重要作用。近年來研究顯示[20-24]，NF-κBIA基因包含多個SNP位點，如-881 A/G（rs3138053）、-826 C>T（rs2233406）、-297 C/T（rs2233409）、3′UTR A>G（rs696），其差別多態性基因與類風濕性關節炎病、潰瘍性結腸炎、炎癥性腸病、多發性硬化癥、帕金森病、以及1型糖尿病等許多慢性炎癥性疾病易感性相關。本研究結果顯示，NF-κBIA基因SNP位點rs3138053與新生兒細菌性腦膜炎發病相關，結果與Baldwin等[25]研究一致。rs2233406（C/C）在病例組中出現的頻率高于對照組，提示患兒與健康新生兒可能存在基因多態性的表達差異。

綜上所述，NF-κBIA基因多態性對新生兒細菌性腦膜炎可能存在較強相關性，對了解新生兒腦膜炎的發生及疑似患兒的篩檢等方面有積極意義。因此，在探究NF-κBIA基因多態性與新生兒細菌型腦膜炎的相關性時，嚴格設計、進一步選擇多中心的大樣本，檢測覆蓋更多不同基因區域的SNP是非常必要的。希望這種遺傳異質性的揭示，為研究新生兒細菌性腦膜炎與基因多態性提供新的遺傳線索。

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（收稿日期：2019-06-17? 本文編輯：劉明玉）