貝利司他抑制骨肉瘤細(xì)胞活力的分子機(jī)制*

彭 斌， 何 敏， 李正茂， 符 勇， 譚文甫

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院創(chuàng)傷骨科， 湖南 衡陽 421002)

骨肉瘤是運動系統(tǒng)常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年。骨肉瘤惡性程度高，早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，即便對于非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者，其5年生存率也僅為60%～70%[1-2]。輔助化療也不能有效提高生存率[3]。因此仍需開發(fā)新的治療藥物來改善骨肉瘤的預(yù)后[4]。

組蛋白乙酰化是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要機(jī)制，它主要通過改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。組蛋白的乙酰化受組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyl transferases，HATs)和組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylases, HDACs)的調(diào)節(jié)[5]。HAT催化乙酰基轉(zhuǎn)移到組蛋白的N端賴氨酸殘基，導(dǎo)致染色質(zhì)構(gòu)象疏松而利于靶基因的轉(zhuǎn)錄，而HDAC恰好相反[6]。某些抑癌基因若發(fā)生HDAC復(fù)合物的異常募集，則可引起其表達(dá)異常而參與腫瘤的發(fā)生,因此，HATs和HDACs是腫瘤治療的重要靶標(biāo)，其相關(guān)藥物在骨肉瘤中的療效也得到了證實[7-8]。

貝利司他(Belinostat)是Topotarget和Spectrum公司聯(lián)合開發(fā)的一種羥肟酸類HDAC抑制劑(histone deacetylase inhibitor，HDACi)，化學(xué)結(jié)構(gòu)上和伏立諾他以及帕比司他屬同類化合物[9]。貝利司他的藥理學(xué)作用和羅米地辛以及普拉曲沙接近，其治療外周T細(xì)胞淋巴瘤的客觀應(yīng)答率(objective response rate, ORR)約為20%[10]。但貝利司他的安全性相對較高，更適合聯(lián)合用藥。貝利司他在治療外周T細(xì)胞淋巴瘤、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、肝癌和胸腺癌等方面具有較好的療效[11]。但目前尚未有關(guān)于貝利司他在骨肉瘤細(xì)胞增殖方面的研究。本項工作旨在探討貝利司他在骨肉瘤細(xì)胞生長增殖中的影響，并觀察其對多柔比星(doxorubicin; 又稱阿霉素)是否具有協(xié)同效應(yīng)，初步探討其作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

貝利司他購自Selleck；磷酸化Akt(Ser473)及Akt、糖原合成酶激酶(glycogen synthetase kinase 3β, GSK-3β)、caspase-3、 Bcl-xL及PTEN抗體購自Cell Signaling；乙酰化組蛋白H3和H4 (Lys5/8/12/16) 多克隆抗體購自Millipore；鼠抗人β-actin抗體購自Santa Cruz。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與活性檢測 人骨肉瘤細(xì)胞系SAOS-2、SJSA和U2OS購自ATCC。細(xì)胞用含有10%胎牛血清、1.0×105U/L青霉素，0.1 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)參考文獻(xiàn)提供的方法，采用MTT法檢測貝利司他對骨肉瘤細(xì)胞活力的影響[12]。即，將細(xì)胞以每孔約2 500個接種在96孔板中(培養(yǎng)液含10%胎牛血清)。 24 h后，細(xì)胞用0.5、1、2.5和5 μmol/L的貝利司他處理48 h。藥物處理后，將22 μL 5%的MTT試劑加入到每個孔中，并將細(xì)胞在37 ℃溫育2～4 h。在酶標(biāo)儀上(UV Spectromax M2，Molecular Devices)上測定570 nm處的吸光度(A)值，并使用CompuSyn軟件計算貝利司他的IC50值。

2.2細(xì)胞凋亡檢測 按照Roche提供的In Situ Cell Death Detection試劑盒測定凋亡后DNA的片段化水平,即用不同濃度的貝利司他處理細(xì)胞48 h后。 獲取約100 000個細(xì)胞，獲取其裂解上清，酶標(biāo)儀上于490 nm波長下獲取其吸光度。

2.3caspase-3/-7活性測定 根據(jù)AnaSpec提供的SensolyteTMHomogeneous AMC caspase-3/-7試劑盒測定caspase-3/-7的活性。即接種在6孔板中的細(xì)胞(約每孔1×105個)用不同濃度貝利司他處理48 h。 孵育結(jié)束后，加入裂解緩沖液至終體積為每孔150 μL，然后將50 μL caspase-3/-7底物試劑加入孔中，并在37 ℃下振蕩溫育30～60 s。最后在熒光酶標(biāo)儀上獲取吸光值，其中Ex/Em=354 nm/442 nm。

2.4Western blot檢測蛋白表達(dá)及磷酸化水平 收集藥物處理48 h后的細(xì)胞，用PBS漂洗后，加入M-PER蛋白提取試劑(Pierce)充分裂解細(xì)胞。以9 000 ×g離心15 min后，經(jīng)SDS-PAGE分離總蛋白，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用含有5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h后，將膜與相應(yīng)的Ⅰ抗4 ℃溫育過夜，然后用TBST洗滌3次后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗在室溫下孵育1 h。最后通過化學(xué)發(fā)光(Perkin-Elmer)、顯影，并進(jìn)行灰度掃描。

2.5藥物聯(lián)合分析 使用固定比率法評估不同貝利司他與阿霉素濃度組合對骨肉瘤細(xì)胞活力的影響。即，將藥物以4∶1的濃度比(貝利司他：阿霉素)組合并進(jìn)行2倍系列稀釋。分別將其與細(xì)胞孵育后后，按照2.3中的方法測定細(xì)胞活力。根據(jù)參考文獻(xiàn)提供的方法[13]，使用CompuSyn軟件分析各藥物及其組合的劑量-效應(yīng)協(xié)同效應(yīng)，并計算聯(lián)合指數(shù)(combination index, CI)值：CI=1，疊加；CI<1，協(xié)同作用；CI>1，拮抗作用。同時也計算了劑量減少指數(shù)(dose reduction index, DRI)，即協(xié)同組合中藥物的劑量與單獨的相同藥物的劑量相比降低的程度的量度，以實現(xiàn)給定的效果水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)重復(fù)測量3次，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。組間比較采用單因素方差分析 (one-way ANOVA)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 貝利司他抑制骨肉瘤細(xì)胞活力

MTT結(jié)果顯示，0.5、1、2.5和5 μmol/L貝利司他處理U2OS和SAOS-2細(xì)胞48 h后，均可抑制其活力，其IC50值分別為1.136 μmol/L和1.261 μmol/L，見圖1。因SJSA細(xì)胞需要孵育72 h后才能觀察到抑制效果，因此隨后的研究中主要選取U2OS和SAOS-2細(xì)胞為研究對象。

Figure 1.Effects of Belinostat at different concentrations on the viability of U2OS and SAOS-2 cells.

圖1 不同濃度貝利司他對U2OS和SAOS-2細(xì)胞活力的影響

2 貝利司他誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡

ELISA結(jié)果顯示，0.5、1和2.5 μmol/L貝利司他能以劑量依賴性方式促進(jìn)U2OS和SAOS-2細(xì)胞DNA片段化，見圖2A。 同時，貝利司他也能上調(diào)U2OS和SAOS-2細(xì)胞caspase-3/-7酶的活性(P<0.05),見圖2B。此外，Western blot顯示貝利司他處理后，細(xì)胞中cleaved caspase-3含量增多，Bcl-xL的含量減少(P<0.05),見圖2C。

Figure 2.Effect of different concentration of Belinostat on DNA fragmentation (A), caspase-3/-7 activity (B), and cleaved caspase-3 and Bcl-xL expression (C). Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖2 貝利司他誘導(dǎo)U2OS和SAOS-2細(xì)胞凋亡

3 貝利司他促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞中組蛋白H3和H4乙酰化

Western blot結(jié)果顯示，分別采用1和 2.5 μmol/L貝利司他處理SAOS-2和U2OS細(xì)胞48 h后，細(xì)胞中乙酰化組蛋白H3(acetylated histone H3, AcH3)和AcH4表達(dá)水平隨著貝利司他濃度的遞增而增高(P<0.05),見圖3。

4 貝利司他影響AKT通路相關(guān)蛋白磷酸化

Western blot結(jié)果顯示，用1和2.5 μmol/L貝利司他處理48 h后，U2OS和SAOS-2細(xì)胞中磷酸化Akt顯著減少(P<0.05); Akt的直接底物GSK-3β的磷酸化水平也顯著降低(P<0.05);此外，1和2.5 μmol/L貝利司他孵育對U2OS和SAOS-2細(xì)胞系中PTEN蛋白表達(dá)無顯著影響(P<0.05)，見圖4。

Figure 3.Effect of Belinostat on the acetylation of histones H3 and H4 in U2OS and SAOS-2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖3 貝利司他對U2OS和SAOS-2細(xì)胞中組蛋白H3和H4乙酰化的影響

Figure 4.Effect of Belinostat on the expression and phosphorylatin of Akt pathway-related proteins in U2OS and SAOS-2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖4 貝利司他對U2OS和SAOS-2細(xì)胞中Akt通路相關(guān)蛋白磷酸化的影響

5 貝利司他增強(qiáng)阿霉素對骨肉瘤細(xì)胞的毒性作用

MTT結(jié)果顯示，貝利司他和阿霉素以固定濃度比組合孵育U2OS和SAOS-2細(xì)胞后，隨著劑量的增加，細(xì)胞活力逐漸降低，見圖5。通過CI和DRI的計算顯示，由于貝利司他與阿霉素之間的協(xié)同作用，其在U2OS細(xì)胞中的IC50值可分別降低為原來的41%和19%，在SAOS-2細(xì)胞中分別降低為原來的58%和24%，見圖5、表1。

Figure 5.Effect of different concentration of Belinostat on U2OS and SAOS-2 cells viability. Mean±SD.n=3.

圖5 不同濃度貝利司他協(xié)同阿霉素抑制U2OS和SAOS-2細(xì)胞活力

表1 貝利司他與阿霉素處理骨肉瘤細(xì)胞的聯(lián)合指數(shù)

Table 1.Combination index (CI) values of Belinostat and doxorubicin at the indicated effective dose (ED) in osteosarcoma cell lines

Cell lineED50ED75ED90ED95U2OS0.720.460.630.85SAOS-20.890.670.140.04

討 論

DNA甲基化和組蛋白乙酰化是細(xì)胞中重要表觀遺傳機(jī)制[14]。HDACi通過促進(jìn)組蛋白乙酰化來調(diào)節(jié)染色質(zhì)的緊密程度，最終影響細(xì)胞增殖分化、周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、遷移和血管生成相關(guān)基因的表達(dá)[15]。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞對HDACi更敏感[16]。貝利司他是2014年FDA批準(zhǔn)上市的一種HDACi，主要用于治療外周T細(xì)胞淋巴瘤。研究表明，貝利司他可抑制多種腫瘤細(xì)胞生長，同時不受多重耐藥表型的影響，此外貝利司他也可以增強(qiáng)多西他賽或卡鉑對卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制效果[17]。在本研究中，我們研究了貝利司對骨肉瘤細(xì)胞生長的影響。MTT結(jié)果顯示，不同的骨肉瘤細(xì)胞系，貝利司他對其生長抑制情況有所不同，在敏感的U2OS和SAOS-2細(xì)胞系中，貝利司他可抑制其活力。為了明確貝利司他是否也能影響骨肉瘤細(xì)胞的凋亡，隨后通過檢測細(xì)胞DNA片段化和caspase-3/-7的活性以間接證實其促凋亡效應(yīng),結(jié)果顯示，細(xì)胞活力降低的同時也伴有凋亡的增加。HDACi的抗腫瘤效應(yīng)通常是通過增加組蛋白乙酰化從而改變基因轉(zhuǎn)錄水平的。因此，我們檢測了HDACi處理后骨肉瘤細(xì)胞中乙酰化組蛋白的水平，結(jié)果顯示貝利司他可增加骨肉瘤細(xì)胞系中的組蛋白乙酰化，此外，還能抑制Akt的磷酸化，表明貝利司他體外對骨肉瘤細(xì)胞具有多效性。

本研究同時也顯示，盡管貝利司他誘導(dǎo)組蛋白乙酰化、抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所需的濃度較低，但和阿霉素共同作用于U2OS和SAOS-2細(xì)胞后，與貝利司他或阿霉素單獨孵育相比，細(xì)胞活力顯著降低，根據(jù)每種細(xì)胞系的單一藥物處理和組合處理后產(chǎn)生的劑量-效應(yīng)數(shù)據(jù)計算出藥物的CI值后發(fā)現(xiàn)，貝利司他/阿霉素組合具有協(xié)同效應(yīng)，兩者聯(lián)合應(yīng)用后，細(xì)胞IC50值顯著降低，與其他研究類似。如HDACi丙戊酸在生理濃度下不影響骨肉瘤細(xì)胞的活性，但能增強(qiáng)其對阿霉素的敏感型，在動物實驗中也具有類似的效果[18]。

總之，本研究表明貝利司他能抑制骨肉瘤細(xì)胞生長，并能協(xié)同阿霉素進(jìn)一步抑制細(xì)胞活力。在未來研究中，將開展動物實驗，并進(jìn)一步優(yōu)化兩者之間的劑量組合，從而為骨肉瘤的治療提供實驗依據(jù)。