苯扎貝特減輕小鼠糖尿病肝損傷*

吳 堃， 蔣青松， 任凱強， 黃 波， 邱紅梅， 韓 萍

(1重慶市人民醫院肝膽外科， 重慶 400013； 2重慶醫科大學藥理教研室， 重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室， 重慶 400016； 3重慶市永川區人民醫院 藥劑科， 重慶 402160； 4遵義醫科大學基礎藥理教育部重點實驗室 暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室， 貴州 遵義 563003； 5重慶市人民醫院腫瘤科， 重慶 400013)

糖尿病是由于胰島素分泌絕對或相對不足，以體內血糖水平持續升高為特征的代謝性疾病。長期高血糖損傷全身大血管和微血管，出現糖尿病心肌病、糖尿病腎病、糖尿病性視網膜病變和糖尿病神經病變等并發癥。據世界衛生組織統計，糖尿病并發癥高達100多種，是目前已知并發癥最多的一種疾病，其中，糖尿病肝病的臨床癥狀較少且表現不典型，故常被忽視。近年，糖尿病患者肝損傷的發生率越來越高，終末期肝病的死亡率也逐漸增加，糖尿病肝病引起了人們的重視[1]。目前，雖然對糖尿病肝病進行了一些研究，但其病理生理機制尚未闡明，仍然缺乏有效的治療手段和針對性藥物。

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)屬于核受體家族成員，是配體依賴的轉錄因子，其3種不同亞型(α、β和γ)均參與體內糖脂代謝、炎癥反應、細胞增殖與分化等重要生物調節過程，其調控異常與糖尿病等代謝紊亂性疾病密切相關[2]。已有研究發現，PPARs受體參與了糖尿病肝病的病理生理過程[3-4]。臨床上，PPARα和PPARγ激動劑貝特類和噻唑烷酮類藥物已分別用于高脂血癥和胰島素抵抗的治療。雖然沒有PPARβ激動劑上市，但動物實驗證實，PPARβ激動在糖尿病及其并發癥的防治中也有重要意義[5]。苯扎貝特(bezafibrate，BEZ)是上市藥物中唯一能夠同時激動PPAR受體3種亞型的藥物，與其它貝特類藥物一樣，BEZ也主要用于高脂血癥的治療。臨床及基礎實驗均顯示[6-7]，BEZ對于糖尿病及其并發癥的防治是有益的，尤其在降低心血管疾病風險方面[8]。但目前對BEZ在糖尿病肝病中的治療作用研究較少，國內未見報道。因此，本研究擬利用小鼠糖尿病肝損傷模型，觀察BEZ的作用及其可能機制。

材 料 和 方 法

1 動物

SPF級雄性昆明小鼠，6～8周齡，體重16～20 g,由重慶醫科大學實驗動物中心提供 [許可證號為SYXK(渝)2012-0001]。

2 主要試劑

BEZ購自Sigma，用0.5% 羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na)制成混懸液；鏈脲菌素(streptozotocin，STZ)購自Sigma，溶于pH 4.2～4.4枸櫞酸鹽緩沖液，現配現用；丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、胰島素和糖化血紅蛋白(HbA1c)檢測試劑盒購自南京建成生物技術公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自江蘇碧云天生物技術公司；TRIzol、逆轉錄試劑盒、SYBR Green Supermix和PCR引物購自TaKaRa；鼠抗PPARα、PPARβ、PPARγ和β-actin多克隆抗體均購自博奧森生物科技公司；ECL化學發光試劑盒購自Thermo;其余試劑均為國產分析純。

3 主要方法

3.1糖尿病肝損傷模型的建立 小鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常對照(normal control,NC)組(n=10)組、高脂飲食對照(high-fat, HF)組(n=10)和模型(model)組(n=26)。模型組小鼠予高糖高脂飼料(成分為10%蔗糖、10%蛋黃、10%豬油、1.5%膽固醇、0.5%膽鹽和68%基礎飼料)喂養4 周后，連續5 d予STZ(40 mg·kg-1·d-1)腹腔注射。7 d后(即STZ 7 d)，用血糖儀(ONETOUCH Ultra)檢測小鼠空腹血糖水平(fasting blood glucose，FBG)，高于11.1 mmol/L的小鼠即為糖尿病小鼠。4周后，隨機取6只糖尿病小鼠檢測肝臟組織病理學和肝功能變化，確定糖尿病肝病形成[9-11]。將剩余的糖尿病小鼠，即糖尿病肝病小鼠隨機分為2組(n=10)，分別灌胃給予相應藥物，持續4 周：(1)糖尿病肝損傷模型(model)組：與BEZ混懸液等劑量的CMC-Na；(2)BEZ給藥治療(BEZ)組：BEZ采用與臨床相當的劑量，即75 mg·kg-1·d-1。此外，NC組小鼠給予常規飼料，HF組予高糖高脂飼料，喂養4 周后，連續5 d腹腔注射等量的枸櫞酸緩沖液，7 d后檢測FBG，繼續給予相應飼料喂養，并予等劑量CMC-Na灌胃，每日1次，持續4 周。每周監測小鼠的FBG。

3.2生化指標檢測 實驗結束時，小鼠眼眶取血，于4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清液分裝凍存于-20 ℃冰箱備用。按照各試劑盒說明書操作，用酶標儀(ELx800，BioTek)分別檢測不同波長吸光度值(AST和ALT：510 nm;TC和TG：490 nm;HbA1c：530 nm), 根據標準曲線計算各相應指標的濃度。另外, 用放射免疫法在γ計數儀上檢測胰島素(insulin，INS)含量，以mU/L表示, 并計算胰島素抵抗指數: HOMA-IR=FBG×INS/22.5。

3.3肝臟組織病理學觀測 分離肝臟組織，4%的多聚甲醛溶液固定6 h，用不同濃度的乙醇和二甲苯逐級脫水，石蠟包埋，作3～5 μm冠狀切片，HE染色，于200倍顯微鏡下觀察肝臟組織形態學變化。

3.4RT-qPCR檢測PPARs的mRNA表達 參照GenBank中小鼠的基因序列合成引物(引物序列見表1)。用TRIzol提取組織總RNA，測定RNA濃度，按照1 μg/20 μg反應體系進行逆轉錄合成cDNA，利用SYBR Green熒光技術，在定量PCR儀器上按如下條件進行擴增：95 ℃ 30 s;95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s，循環40次。以β-actin作為內參照，對Ct值進行統計，根據相對定量公式分析結果。

3.5Western blot法檢測PPARs蛋白表達 肝臟組織液氮冷凍后勻漿提取總蛋白，用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度。取30 μg總蛋白進行SDS-PAGE，轉移至PVDF膜上，5% BSA封閉2 h，加入 I 抗[anti-PPARα (1∶1 000)、anti-PPARβ(1∶1 000)、anti-PPARγ(1∶1 000)和anti-β-actin(1∶2 000)]，4 ℃搖床過夜，加入辣根過氧化物酶標記的 II 抗 (1∶2 000)。用發光液顯色凝膠成像儀成像后用Image Lab軟件分析結果。

4 統計學處理

采用SPSS 20.0進行統計學分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，用Excel和GraphPad Prism 5.01等軟件作圖。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 BEZ對小鼠糖尿病相關指標的影響

給予STZ 7天后，小鼠FBG水平顯著升高(P<0.01)，且模型小鼠FBG一直維持較高水平直至實驗結束，INS、HbA1c和HOMA-IR的水平亦明顯增加(P<0.01)；BEZ顯著降低糖尿病小鼠FBG(P<0.01)，但仍維持在較高水平，亦使INS、HbA1c和HOMA-IR明顯降低(P<0.01)；與NC組比較，HF對照組FBG的水平無明顯變化，INS、HbA1c和HOMA-IR有增加趨勢，但差異無統計學顯著性(P>0.05)，見圖1、表2。

Figure 1.The effect of bezafibrate (BEZ) on fast blood glucose (FBG) level of the mice. DM： diabetes mellitus; DH: diabetic hepatopathy.Mean±SD.n=10.##P<0.01vsNC group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

圖1 苯扎貝特對小鼠空腹血糖的影響

表2 苯扎貝特對糖尿病小鼠胰島素、HbA1c和HOMA-IR的影響

Table 2.The effect of bezafibrate (BEZ) on the levels of insulin, HbA1c and HOMA-IR in the diabetic mice (Mean±SD.n=10)

GroupInsulin(mU/L)HbA1c(/10 g Hb)HOMA-IRNC28.5±3.524.8±5.17.4±0.6HF31.6±6.429.5±2.210.2±2.7Model101.6±12.8##61.0±8.9##105.6±17.3##BEZ44.9±5.4**36.2±5.5**38.2±7.4**

##P<0.01vsNC group;**P<0.01vsmodel group.

2 BEZ對糖尿病小鼠肝臟結構和功能及血脂的影響

實驗結束時，模型小鼠肝功能指標AST和ALT水平較正常組顯著升高(P<0.01)；HE染色顯示肝細胞腫脹，排列紊亂，肝小葉結構消失，細胞內出現大量脂肪空泡，胞漿內可見大小不一脂滴，局部伴有炎癥細胞浸潤，出現了明顯的肝損傷；同時，TC和TG也明顯升高(P<0.01)。HF組的AST和ALT有增加趨勢，但差異無統計學顯著性(P>0.05)；肝臟結構基本正常，細胞內有少量脂肪空泡及脂滴，未見炎癥細胞浸潤；TC和TG也增加(P<0.05)，但分別只有模型組水平的25.5%和38.5%。BEZ明顯減輕模型小鼠肝臟功能和結構的改變，使糖尿病肝損傷小鼠的AST和ALT均降低(P<0.01)；病理損傷明顯減輕，但仍可見少量脂滴；TC和TG水平也下降(P<0.01)，見表3、圖2。

表3 苯扎貝特對糖尿病小鼠血脂和肝功能的影響

Table 3.The effect of bezafibrate (BEZ) on the levels of TC, TG, ALT and AST in the diabetic mice (Mean±SD.n=10)

GroupTC(mg/dL)TG(mg/dL)AST(U/L)ALT(U/L)NC34±315±341±642±5HF40±4*25±8*44±750±10Mod-el157±19##65±7##99±8##97±6##BEZ44±9**29±4**74±6**72±10**

##P<0.01vsNC group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

Figure 2.The effect of bezafibrate (BEZ) on the histopathological changes of liver tissues in the diabetic mice (HE staining, ×200). A: NC group; B: HF group; C: model group; D: BEZ group.

圖2 苯扎貝特對糖尿病小鼠肝臟組織病理形態的影響

3 BEZ對肝臟PPARs的mRNA和蛋白表達的影響

模型組小鼠肝臟PPARs的mRNA明顯下降(P<0.01)，蛋白表達也明顯下調(P<0.01);BEZ使模型組PPARα、PPARβ和PPARγ的mRNA和蛋白表達均上調(P<0.05)；值得注意的是，與NC組比較，除了PPARβ的蛋白表達外，高脂飲食對照組小鼠肝臟PPARs的mRNA和蛋白的表達也下調(P<0.05)，但其下調程度不如模型組,見圖3、4。

討 論

糖尿病是肝臟疾病發生發展的獨立危險因素，約超過70%的糖尿病患者出現肝臟損傷[12]；同時，肝臟病變引起的胰島素敏感性降低及糖脂代謝異常反過來也可導致或加快糖尿病的進展[13]。因此，糖尿病并發的肝損害也被稱為糖尿病性肝病(diabetic hepatopathy)，包括以肝細胞內脂質的過度累積為特征的非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)，而后炎癥因子產生，成為非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，再進一步惡化，肝臟出現纖維化，甚至肝硬化，最終出現肝功能衰竭[14]。

Figure 3.The effect of bezafibrate (BEZ) on the mRNA expression of PPARs in the liver tissues of diabetic mice. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsNC group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

圖3 苯扎貝特對糖尿病小鼠肝臟PPARs mRNA表達的影響

Figure 4.The effect of bezafibrate (BEZ) on the protein expression of PPARs in the liver tissues of diabetic mice. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsNC group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

圖4 苯扎貝特對糖尿病小鼠肝臟PPARs蛋白表達的影響

我們前期研究已經證實，長期高脂飲食聯合STZ多次小劑量給予形成糖尿病4周后可建立糖尿病肝病模型[9-11]。本研究中，模型小鼠FBG水平持續高于11.1 mmol/L，提示糖尿病形成且穩定。實驗結束時，INS、HbA1c及HOME-IR均明顯增加，TCH和TG也明顯上升，提示模型小鼠出現胰島素抵抗，并伴發血脂紊亂。組織形態學檢查發現，模型小鼠肝細胞內脂肪變性并伴有炎癥細胞浸潤，提示其肝損傷已進展至NASH階段。模型小鼠血清的AST和ALT水平亦顯著升高，提示其肝臟功能也出現損害。需要注意的是，高脂飼料對照組小鼠的TC和TG增加，但其AST和ALT基本正常，同時肝細胞內有少量脂肪空泡及脂滴，提示長期高脂飲食引起血脂紊亂，導致輕度脂肪肝形成。臨床研究證實，高脂飲食可導致脂肪肝發生[15]。但在本實驗時間內，肝功能尚未出現異常。由于HF組小鼠的FBG和INS等糖尿病相關指標仍處于正常范圍，故在本實驗條件下和觀察時間內，單獨高脂飲食不能導致糖尿病肝病形成。

目前對BEZ的研究主要集中于其降血脂作用。在糖尿病患者，BEZ除了有效改善其糖脂紊亂外，也能減少心血管疾病風險，降低患者死亡率[7]。在小鼠糖尿病心肌肥厚和糖尿病腎病模型，BEZ也有保護作用[16-17]。本實驗中，給予BEZ治療后，模型小鼠AST和ALT水平降低，肝損傷病理狀態改善，提示BEZ對糖尿病肝臟結構和功能的損傷均有改善作用。雖然BEZ在一定程度上降低了糖尿病小鼠FBG水平，但仍遠高于11.1 mmol/L糖尿病的診斷標準，提示對血糖的調節可能不是BEZ保護糖尿病肝損傷作用的主要機制。與Franko等[6]的研究結果一致，BEZ也使TCH和TG水平也下降，INS、HbA1c和HOMA-IR明顯降低，提示在糖尿病肝病小鼠模型，除了降血脂作用外，BEZ對胰島素抵抗也有一定的改善作用。

我們前期研究已經發現，PPARs相關信號通路參與了糖尿病肝損傷的發生發展過程[11]，PPAR各受體亞型可能是糖尿病肝損傷防治的重要靶點。在高脂飼料對照組，小鼠肝臟PPARs的mRNA和蛋白表達也減少，提示長期高能量飲食對PPARs信號通路可能也有損傷作用。BEZ是PPAR泛激動劑，可同時激動PPARα、PPARβ和PPARγ受體，但目前對BEZ糖尿病肝損傷與PPARs之間的研究較少。本研究結果顯示，BEZ在減輕糖尿病肝損傷的同時，對PPARα、PPARβ和PPARγ 的mRNA和蛋白表達表現出明顯的上調作用。這些結果證實，BEZ減輕糖尿病肝損傷的作用可能與其激活PPARs受體，從而調控相關因子的生成有關。

綜上所述，本研究結果提示，BEZ具有減輕糖尿病肝損傷的作用，其機制可能與BEZ對PPARα、PPARβ及PPARγ的激活有關。除了PPARs相關因素，BEZ的作用是否還有其它機制參與，還需要進行更多深入研究。