ClC-3氯通道在二甲雙胍抑制鼻咽癌細胞周期進程中的作用*

葉 東， 李坤鈺， 蔡曉萍， 陳綺婷， 曾 志， 余小慧

(廣東藥科大學 1生命科學與生物制藥學院， 2臨床醫學院， 廣東 廣州 510006； 3暨南大學基礎醫學院， 廣東 廣州 510632)

鼻咽癌是在我國南方及東南亞地區具有較高發病率的一種惡性腫瘤，在我國尤其好發于廣東、廣西、湖南等地。由于鼻咽部比較隱蔽，多數鼻咽癌患者被診斷時已處于中晚期，惡性程度比較高且具有極強的侵襲能力，嚴重影響人民群眾的健康。二甲雙胍是目前全球應用最廣泛的口服降糖藥之一，但近年的研究表明，其除了具有傳統的降血糖作用外，還具有抑制胃癌[1]、肺癌[2]和卵巢癌[3]等腫瘤發生和發展的作用，其在腫瘤的預防和治療中可能發揮重要作用。因此，探究二甲雙胍對鼻咽癌周期進程的影響及作用機制將會為臨床鼻咽癌的治療提供相關參考。

二甲雙胍的抗腫瘤作用機制尚不明確。加拿大研究團隊通過“同源物動力學”蛋白片段互補分析技術發現二甲雙胍至少能影響包括相關轉運功能蛋白在內的745種蛋白的活性[4]。這提示二甲雙胍的抗腫瘤作用可能與離子通道轉運功能相關。正常的離子通道結構和功能是細胞進行生命活動的基礎。氯離子通道普遍分布于各類生物體的細胞中，其中ClC-3氯通道(又稱氯離子轉運體ClC-3或氯離子通道蛋白3，基因符號為CLCN3)作為容積敏感性氯電流通道蛋白廣泛表達[5-6]。研究表明ClC-3氯通道不僅僅只發揮離子通道的作用，還參與細胞周期調控等很多重要的生理活動[7-9]。

我們前期研究顯示敲減ClC-3氯通道基因表達可使細胞停滯于G0/G1期進而抑制鼻咽癌細胞周期進程，提示ClC-3氯通道在鼻咽癌細胞周期進程調控中起著重要作用[10]。而二甲雙胍對鼻咽癌細胞的作用是否與ClC-3氯通道有關尚未見報道。據此，本研究以低分化鼻咽癌CNE-2Z細胞為研究對象，采用流式細胞術、Western blot、膜片鉗等實驗方法，探討二甲雙胍對鼻咽癌細胞周期進程的影響以及ClC-3氯離通道在其中的作用，以期為臨床治療鼻咽癌提供參考。

材 料 和 方 法

1 細胞

本研究中所用到的人低分化鼻咽癌CNE-2Z細胞由廣東醫科大學病理教研室惠贈。

2 主要試劑

二甲雙胍購于上海碧云天公司；RPMI-1640細胞培養基、胎牛血清及質粒轉染專用培養液Opti-MEMI購于Gibco；CCK-8試劑盒購自Dojindo；抗ClC-3抗體購自Abcam；抗GAPDH抗體購自博士德生物科技有限公司； HRP標記的山羊抗兔 II 抗與山羊抗鼠 II 抗購自ProteinTech Group；質粒轉染試劑LipofectamineTM3000購自Invitrogen。

3 主要方法

3.1鼻咽癌CNE-2Z細胞的培養 人低分化鼻咽癌CNE-2Z細胞用含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和1×105g/L鏈霉素的RPMI-1640培養液，在含5% CO2、37 ℃培養箱中培養，每48 h進行1次傳代。

3.2ClC-3氯通道基因高表達質粒pEZ-M03-ClC-3轉染鼻咽癌CNE-2Z細胞 常規細胞培養方法培養CNE-2Z細胞；轉染前1天將對數生長期的細胞接種于6孔板中，并用不含抗生素的培養液培養細胞；當細胞生長融合度達到50%～60%時進行細胞轉染；細胞轉染前各用100 μL Opti-MEMI培養液稀釋pEZ-M03-ClC-3質粒和轉染試劑LipofectamineTM3000，將2者混勻成轉染復合體，在室溫下，靜置5～10 min；用無血清培養液將孔板中的細胞洗2～3次，并在每孔中加2 mL培養液；將以上制得的200 μL轉染復合體加到培養孔板中進行瞬時轉染，在正常培養條件下繼續培養。除pEZ-M03-ClC-3轉染組外，另外設置pEZ-M03空質粒對照組。

3.3CCK-8法檢測細胞活力 取96孔板，設置6組，每組設置5個復孔。細胞種板后將96孔板置于含5% CO2、37 ℃的恒溫細胞培養箱中培養12 h使細胞貼壁后，每孔加入100 μL含有不同濃度的二甲雙胍培養液，濃度依次為0、0.625、1.25、2.5、5、10和20 mmol/L，加藥后繼續放置于含5% CO2、37 ℃的恒溫細胞培養箱中培養48 h，每孔加入100 μL含有10% CCK-8的培養液，在含5% CO2、37 ℃的恒溫細胞培養箱中避光孵育30 min后取出，在酶標儀上測定450 nm波長處吸光度(A)值。

3.4流式細胞術檢測細胞周期分布 收集6孔培養板各孔的原始培養液作好標記。再用0.25%胰酶消化細胞，制成細胞懸液，分別收集細胞于含有原培養液的15 mL離心管中，常溫下1 000 r/min 離心5 min，小心棄掉上清液后于離心管中加入1 mL預冷過的PBS緩沖液洗滌細胞，將細胞依次分裝于1.5 mL EP管中，然后在低速冷凍離心機中4 ℃、1 000 r/min 離心5 min，棄掉上清液并加入1 mL預冷過的75%冰乙醇固定細胞，輕柔吹打均勻，放在4 ℃冰箱中保存過夜。用細胞周期檢測試劑盒處理樣品。將樣品在低速冷凍離心機中4 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清液。再用1 mL PBS緩沖液洗滌細胞，同樣在低速冷凍離心機中4 ℃、1 000 r/min離心5 min，小心棄去上清液。往樣品中加入100 μL RNase A 37 ℃水浴孵育30 min，再加入400 μL PI染料染色均勻，4 ℃避光30 min。用流式細胞儀測定細胞中DNA含量，用軟件分析各時相細胞百分率。

3.5全細胞膜片鉗技術記錄細胞氯電流 按照常規細胞培養方法培養CNE-2Z細胞，消化后輕輕吹打制成單個細胞懸液；將細胞懸液滴到已消毒且直徑為22 mm的圓形玻片上(100～200 μL/片)，放置培養皿內，并在37 ℃培養箱內培養0.5～1 h，即等到細胞貼壁后方可開始后面的實驗；拉制玻璃微電極；電鍍電極銀絲；充灌微電極內液；形成高阻抗封接,此時便可得到細胞貼附式膜片鉗模式；建立記錄系統；測定細胞膜電容；全細胞記錄形成、測定電容之后，繼續用等滲灌流液灌流，記錄全細胞氯電流；當此氯電流達到峰值并趨于平穩后，改用高滲灌流液進行灌流，直到氯電流達到峰值并趨于平穩(20～30 min)；再換低滲灌流液，待到最小值并趨于平穩(5～10 min)，記錄氯電流。

3.6Western blot檢測ClC-3蛋白的表達 使用6孔培養板進行CNE-2Z細胞種板待貼壁后，加入10 mmol/L濃度的二甲雙胍，同時設置不加藥空白對照組。放置于5% CO2、37 ℃的恒溫細胞培養箱中培養48 h后，收集細胞總蛋白并進行BCA蛋白定量，然后95 ℃加熱3～5 min進行變性；用10%的SDS- PAGE進行蛋白分離后采用半干法進行轉膜；5%脫脂奶粉室溫下孵育封閉1～1.5 h后加入用抗體稀釋液稀釋的Ⅰ抗4 ℃孵育過夜；用TBST漂洗，每次5～10 min，洗滌3次；加入HRP標記的Ⅱ抗，在室溫下孵育1 h后用TBST漂洗 5～10 min，洗滌3次；采用ECL化學發光法進行顯影；采用圖像分析軟件Image J進行圖像分析。

4 統計學處理

實驗數據用SPSS 16.0統計軟件進行分析。實驗均重復3次以上，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 二甲雙胍抑制鼻咽癌細胞的活力

在CNE-2Z細胞加入含有濃度依次為0、0.625、

1.25、2.5、5、10和20 mmol/L的二甲雙胍培養液培養48 h，通過CCK-8法檢測鼻咽癌細胞的活力，結果顯示5 mmol/L、10 mmol/L和20 mmol/L濃度的二甲雙胍都可有效抑制鼻咽癌細胞的活力，見圖1。結合不同濃度二甲雙胍對鼻咽癌細胞活力的影響，我們在后續研究中將采用10 mmol/L的濃度作為二甲雙胍的加藥濃度。

Figure 1.Metformin inhibited the viability of nasopharyngeal carcinoma cells at 5, 10 and 20 mmol/L. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L group.

圖1 二甲雙胍抑制鼻咽癌細胞的活力

2 二甲雙胍阻抑鼻咽癌細胞周期停滯在G0/G1期

加入10 mmol/L的二甲雙胍處理CNE-2Z細胞48 h后，收集細胞，通過流式細胞術分別檢測二甲雙胍加藥組和空白對照組的細胞周期分布，結果如圖2所示。正常培養48 h的空白對照組CNE-2Z細胞的G0/G1期細胞所占的百分率為(56.9±2.8)%，S期細胞所占的百分率為(32.1±1.7)%，G2/M期細胞所占的百分率為(11.0±1.1)%；而在二甲雙胍加藥組，G0/G1期細胞所占百分率顯著提高到(69.9±3.0)%，S期細胞所占百分率下降到(23.5±1.5)%，G2/M期細胞所占百分率減少到(6.5±1.5)%。結果表明二甲雙胍可阻抑鼻咽癌CNE-2Z細胞的周期，使其停滯在G0/G1期。

Figure 2.Arrest of CNE-2Z cells at G0/G1phases by metformin. The cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry in the control cells and the cells treated with metformin at 10 mmol/L for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2 二甲雙胍阻抑鼻咽癌細胞周期于G0/G1期

3 二甲雙胍抑制鼻咽癌細胞的氯電流

在CNE-2Z細胞加入10 mmol/L的二甲雙胍培養48 h后，收集細胞，通過膜片鉗分別檢測二甲雙胍加藥組和空白對照組的細胞在等滲溶液和低滲溶液中的全細胞氯電流，結果發現10 mmol/L的二甲雙胍作用48 h后可使鼻咽癌細胞的氯電流明顯降低，見圖3，表明二甲雙胍可阻抑鼻咽癌細胞的氯電流。

Figure 3.Inhibition of hypotonicity-activated Cl-currents by metformin in the CNE-2Z cells Hypo: hypotonic perfusion liquid; Hyper: hypertonic perfusion liquid. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3 二甲雙胍抑制鼻咽癌細胞氯電流

4 二甲雙胍抑制ClC-3氯通道蛋白的表達

在CNE-2Z細胞加入10 mmol/L的二甲雙胍培養48 h后，收集細胞提取總蛋白，通過Western blot檢測各組細胞ClC-3氯通道蛋白的表達情況，結果發現10 mmol/L濃度的二甲雙胍加藥作用48 h后，鼻咽癌細胞ClC4-3氯通道蛋白的表達水平明顯受到抑制，見圖4。

Figure 4.Inhibition of ClC-3 protein expression by metformin in the CNE-2Z cells. The protein levels of ClC-3 and the control GAPDH were determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 二甲雙胍抑制ClC-3氯通道蛋白的表達

5 ClC-3氯通道蛋白高表達可逆轉二甲雙胍對CNE-2Z細胞周期分布的影響

構建質粒pEZ-M03-ClC-3并轉染鼻咽癌CNE-2Z細胞后，Western blot檢測顯示質粒pEZ-M03-ClC-3轉染后的鼻咽癌CNE-2Z細胞中ClC-3氯通道蛋白高表達，見圖5。細胞周期檢測結果顯示，PEZ-MO3-ClC-3質粒轉染組細胞的G0/G1期細胞比率明顯低于二甲雙胍單獨處理組，表明ClC-3氯通道蛋白高表達可逆轉二甲雙胍對CNE-2Z細胞周期分布的影響，見圖6。

Figure 5.Over-expression of ClC-3 protein expression by pEZ-M03-ClC-3 plasmid transfection in the CNE-2Z cells. The protein levels of ClC-3 and the control GAPDH were determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5 pEZ-M03-ClC-3質粒轉染后，鼻咽癌CNE-2Z細胞ClC-3氯通道蛋白高表達

Figure 6.ClC-3 chloride channel protein over-expression reversed the effect of metformin on the cell cycle distribution of the CNE-2Z cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmetformin group.

圖6ClC-3氯通道基因高表達可逆轉二甲雙胍對CNE-2Z細胞周期分布的影響

討 論

在用二甲雙胍治療糖尿病的過程中，研究發現其具有抑制腫瘤的發生和發展的作用，但是二甲雙胍的抗腫瘤作用機制尚不明確。最新研究顯示二甲雙胍能影響包括轉運蛋白在內的745種蛋白的活性[4]，其抗腫瘤作用可能與離子通道轉運功能密不可分。氯通道在周期進程和周期分布的調節中發揮重要作用[11-13]。ClC-3氯離子通道蛋白的表達和分布是呈現細胞周期依賴性的[14]，提示ClC-3可能參與細胞周期調控。在鼻咽癌細胞中，cyclin D1可調節ClC-3氯離子通道蛋白的表達與活性[15]。我們前期研究顯示沉默ClC-3氯通道基因表達可使細胞停滯于G0/G1期進而抑制鼻咽癌周期進程，提示ClC-3氯通道在鼻咽癌周期進程和周期調控中起著重要作用[10]。

由此本研究提出3個關鍵科學問題：(1)二甲雙胍是否可以抑制鼻咽癌細胞周期進程？(2)二甲雙胍是否影響鼻咽癌細胞ClC-3氯通道功能和蛋白表達？(3)二甲雙胍是否通過抑制ClC-3氯通道功能和蛋白的表達使細胞周期停滯？

首先，我們證明了二甲雙胍是通過阻抑鼻咽癌細胞周期使其停滯在G0/G1期從而抑制鼻咽癌周期進程的：本研究結果顯示二甲雙胍使鼻咽癌細胞處在G0/G1期的細胞百分數明顯高于非加藥空白對照組，G0/G1期細胞增加，S期和G2/M期細胞減少，這提示二甲雙胍是影響細胞周期從G0/G1期進入S期的重要因素之一。其次，我們證明了二甲雙胍作用于鼻咽癌細胞后，可以影響鼻咽癌細胞的氯通道功能和蛋白表達：本研究結果顯示二甲雙胍抑制鼻咽癌細胞細胞氯電流和ClC-3氯通道蛋白的表達。最后，我們證明了二甲雙胍是通過抑制ClC-3氯通道蛋白的表達使細胞周期停滯從而抑制鼻咽癌細胞周期進程的：本研究結果顯示，二甲雙胍組G0/G1期細胞所占的百分率明顯高于非加藥空白對照組，二甲雙胍可阻抑鼻咽癌細胞周期使其停滯在G0/G1期;高表達ClC-3氯通道蛋白的質粒pEZ-M03-ClC-3轉染鼻咽癌CNE-2Z細胞后，二甲雙胍對鼻咽癌細胞周期的影響被逆轉。我們前期的研究發現ClC-3氯通道蛋白可以通過影響相關周期蛋白cyclin D1、CDK4/CDK6、p21和p27的表達來調控細胞周期[10]。二甲雙胍抑制鼻咽癌細胞ClC-3氯通道蛋白的表達后，可能影響了CDK4/CDK6、P21/27等相關周期蛋白的合成和活性，進而影響細胞周期從G0/G1期通過進入S期，具體的機制需要進一步驗證。

綜上所述，二甲雙胍通過抑制鼻咽癌細胞ClC-3氯通道蛋白的表達和氯通道功能使細胞周期停滯于G0/G1期，從而抑制鼻咽癌細胞的周期進程