羥基紅花黃色素A通過激活Kv通道舒張大鼠冠狀動脈*

楊 蓉， 趙煥新， 季新燕， 翟曉艷， 楊李旺

(山西中醫藥大學基礎醫學院， 山西 太原 030024)

冠狀動脈是給心臟提供血液供應的主要動脈，其正常的舒縮功能是保證心肌充足的供血供氧的前提。若冠狀動脈過度收縮，則心肌供血供氧減少，就會誘發心絞痛、心肌梗死、甚至冠心病猝死等冠狀動脈性疾病(又稱缺血性心臟病)，舒張冠狀動脈對防治心臟缺血性疾病具有重大意義。

血管平滑肌細胞是構成血管壁組織及維持血管張力的主要細胞成分，在心血管系統疾病的發生發展中扮演著重要角色。電壓門控性鉀通道(voltage-gated K+channels，Kv channels)是維持血管平滑肌細胞正常膜電位和肌張力的重要通道[1-2]。

紅花為傳統的活血化瘀類中藥,紅花黃色素是從紅花中提取的水溶性活性成分，為紅花的主要藥效成分，屬于黃酮類化合物。羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)是紅花黃色素結構已經明確的有效單體成分，分子式為C27H32O16，屬小分子查爾酮葡萄糖苷類物質。近年來對HSYA舒張血管作用研究頗多，對其舒張機制也進行了初步探討[3-6]，但HSYA對大鼠冠狀動脈(rat coronary artery,RCA)的舒張作用及其與Kv通道的關系卻未見報道。

本研究擬采用 DMT 離體血管環技術明確HSYA對RCA的肌源性反應；采用全細胞膜片鉗技術觀察HSYA對 RCA平滑肌細胞Kv電流的影響；采用Western blot技術探討HSYA對RCA平滑肌細胞 Kv1.2和 Kv1.5通道蛋白表達的影響，為HSYA防治心臟缺血性疾病提供藥理學理論依據。

材 料 和 方 法

1 動物

正常成年雄性 Sprague-Dawley (SD)大鼠，體重 220～240 g，購自山西醫科大學實驗動物中心，動物許可證號為SCXK(晉)2017-0001。

2 主要試劑

羥基紅花黃色素 A(Q-008-170303)購自成都瑞芬思生物科技有限公司，純度>98%；U46619、二硫丁四醇、木瓜蛋白酶、白蛋白、膠原蛋白F和膠原蛋白H購自Sigma；兔源Kv1.2和Kv1.5抗體購自Alomone Labs；其余試劑購自武漢博士德生物工程有限公司。

3 實驗儀器

Multi Myograph System-610離體微血管環張力記錄儀(DMT)；膜片鉗放大器(Axon)；垂直電泳系統(Bio-Rad)。

4 實驗方法

4.1RCA血管環的制備 大鼠麻醉后取心臟置于預冷(4 ℃)、pH 7.4且氧飽和的生理鹽溶液中，分離冠狀動脈，制備冠脈血管環，將其固定于DMT微血管環張力記錄儀上。依據文獻方法[7]，用60 mmol/L KCl收縮RCA，當收縮幅度大于2 mN時，認為血管環反應性良好，可用于后續正式實驗。

4.2HSYA對預收縮RCA血管環的舒張作用 向DMT浴槽中分別加入60 mmol/L KCl或0.1 mmol/L U46619，待血管收縮達坪臺時，再向浴槽中累積加入3 μmol/L、10 μmol/L和30 μmol/L的HSYA，觀察HSYA對預收縮RCA血管環的舒張作用。

4.3內皮對HSYA舒張U46619 預收縮RCA血管環作用的影響 用比冠狀動脈內徑稍細的金屬絲輕輕穿過血管環，反復2～3次，機械性去除冠脈血管內皮[8]。依據文獻方法[9]，用60 mmol/L KCl收縮去內皮的RCA血管環，當收縮達坪臺時，加入1 μmol/L 乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)舒張血管，若舒張百分比不足60 mmol/L KCl收縮幅度的40%，則認為內皮去除。在內皮完整組和去內皮組分別加入0.1 mmol/L U46619，待血管收縮達坪臺時，再向浴槽中累積加入上述濃度的HSYA，觀察內皮對HSYA舒張預收縮(0.1 mmol/L U46619)冠脈血管環作用的影響。

4.4HSYA對RCA平滑肌細胞Kv電流的影響 參照文獻[7]，在37 ℃恒溫且氧飽和條件下，將分離出的RCA放入細胞酶解液Ⅰ(細胞分離液中加入0.5 g/L木瓜蛋白酶、1 g/L白蛋白和1 g/L二硫丁四醇)中，孵育20 min，之后將其轉移至細胞酶解液Ⅱ(細胞分離液中加入1 g/L白蛋白、0.5 g/L膠原蛋白F和0.5 g/L膠原蛋白H)中，孵育10 min后，用滴管輕輕吹打RCA血管環，使平滑肌細胞從血管環骨架上脫落下來。用連續電壓刺激(-60 mV～+60 mV，步階10 mV)RCA平滑肌細胞，以全細胞膜片鉗方式記錄不同濃度的HSYA對RCA平滑肌細胞Kv電流的影響，用細胞的電容標化其電流，實驗結果用電流密度(pA/pF)表示。

4.5HSYA對RCA平滑肌細胞Kv1.2和Kv1.5通道蛋白表達的影響 參照文獻[7]將收集的去內皮的冠狀動脈分組孵育不同濃度的HSYA，8 h 后取出各組血管環，液氮速凍后，-80 ℃保存。加RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。等量各組總蛋白經SDS-PAGE后電轉移至NC膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h。根據目的蛋白的分子量，以Marker為參照，將NC膜裁剪至合適大小后置于Kv1.2 (1∶400)和Kv1.5 (1∶400) I抗中，4 ℃孵育過夜。之后，將NC膜放入辣根酶標記的 II 抗中，孵育60 min。目的蛋白以 GAPDH 為內參照，ECL化學發光顯色，在Bio-Rad凝膠成像儀中成像并拍照，結果采用ImageJ軟件進行分析。

5 統計學處理

采用 SPSS 23.0 對數據進行統計分析。實驗結果均以均數±標準差(mean±SD)表示，兩樣本間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統計學意義。采用GraphPad Prism 8 制作統計圖。

結 果

1 HSYA對預收縮RCA血管環的舒張作用

60 mmol/L KCl和0.1 mmol/L U46619收縮RCA血管環的幅度分別為(3.57±0.12) mN和(3.76±0.19) mN。10 μmol/L和30 μmol/L HSYA可顯著舒張預收縮的冠脈血管環(P<0.05)，使60 mmol/L KCl預收縮的冠脈血管環收縮幅度分別降低至(3.27±0.20) mN和(2.94±0.17) mN，使0.1 mmol/L U46619預收縮的冠脈血管環收縮幅度分別降低至(3.47±0.16) mN和(3.03±0.17) mN，見圖1。

Figure 1.HSYA-induced vasorelaxation in KCl- and U46619-precontracted RCA rings. Means ±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1 HSYA對KCl和 U46619預收縮大鼠冠脈血管環的舒張作用

2 內皮對HSYA舒張U46619預收縮RCA血管環作用的影響

內皮完整組與去內皮組HSYA舒張U46619(0.1 mmol/L)預收縮RCA血管環的作用的差異無統計學顯著性(P>0. 05)，見圖2。

Figure 2.HSYA-induced vasorelaxation in endothelium-intact (End+) or -denuded (End-) RCA rings precontracted with U46619. Means±SD.n=6.

圖2 HSYA對U46619 預收縮的內皮完整組和去內皮組RCA血管環的影響

3 HSYA對RCA平滑肌細胞Kv電流的影響

在測試電壓為+60 mV 時，RCA平滑肌細胞正常Kv電流密度為(43.74±6.09) pA/pF。HSYA可濃度依賴性增加Kv電流密度，3 μmol/L、10 μmol/L和30 μmol/L HSYA分別使Kv電流密度增加至(51.26±4.77) pA/pF、(67.81±5.08) pA/pF和(80.67±5.96) pA/pF，以上差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

4 HSYA對RCA平滑肌細胞Kv1.2和Kv1.5通道蛋白表達的影響

與control組比較，10 μmol/L和30 μmol/L HSYA可使RCA平滑肌細胞Kv1.2通道蛋白表達顯著增加(P<0.05)，增加的百分率分別為(30.91±6.88)%和(39.18±7.11)%；HSYA(10 μmol/L和30 μmol/L)也可使Kv1.5通道蛋白表達分別顯著增加(28.16±5.87)%和(40.31±6.87)%(P<0.05)，見圖4。

討 論

目前大量研究已肯定了HSYA對心血管系統的藥理作用，HSYA可以抗心肌缺血[10]、抗氧化[11]、調節血管內皮細胞[12]、舒張大鼠主動脈[6]和豬冠狀動脈[4]。本實驗結果顯示，HSYA對KCl和U46619預收縮的RCA有顯著舒張作用，但其對U46619預收縮的內皮完整組和去內皮組RCA舒張作用無統計學差異，說明HSYA舒張RCA的作用與內皮無明顯關系。

Figure 3.The effect of HSYA on Kv currents in freshly isolated RCA smooth muscle cells. A: original recordings of the outward currents evoked by a series of depolarizing pulses (from -60 mV to +60 mV in 10-mV increments for 500 ms duration) in the absence (control) or presence of HSYA (3 μmol/L, 10 μmol/L and 30 μmol/L); B: the current-voltage curves. Means±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3 HSYA對RCA平滑肌細胞Kv電流的影響

Figure 4.The effect of HSYA on the protein expression of Kv1.2 (A) and Kv1.5 (B) in the RCA smooth muscle cells. Means±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

圖4 HSYA對RCA平滑肌細胞Kv1.2和Kv1.5蛋白表達的影響

血管平滑肌細胞上分布有多種離子通道，鉀離子通道主要包括4種：Kv、鈣依賴性的鉀通道(Ca2+-dependent potassium channel，KCa)、ATP敏感的鉀通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)和內向整流鉀通道(inwardly-rectifying potassium channel，KIR)，其中Kv通道在維持細胞正常膜電位和調節冠狀動脈血流方面起著至關重要的作用[1, 13]。全細胞膜片鉗實驗結果表明，HSYA可濃度依賴性增加RCA平滑肌細胞Kv電流，說明經由Kv通道促進K+外流是HSYA舒張RCA的關鍵因素。

到目前為止，已經明確的Kv通道已有12個家族、40多種亞型[14]，在動脈平滑肌細胞上Kv1.2和Kv1.5通道發揮重要作用[15]。為了進一步明確HSYA舒張RCA平滑肌的機制，及參與此作用的Kv通道亞型，我們采用Western blot法觀察了HSYA對RCA平滑肌上Kv1.2和Kv1.5通道蛋白表達的影響。實驗結果表明，HSYA可以使RCA平滑肌細胞Kv1.2和Kv1.5通道蛋白表達顯著增加，從而在分子層面證實HSYA舒張RCA與Kv通道有關，同時提示Kv1.2和Kv1.5通道參與了HSYA對RCA的舒張作用。

綜上所述，本實驗結果表明HSYA可舒張預收縮的RCA，該作用與血管內皮無關，其可能的機制是通過增強Kv通道功能和蛋白表達而舒張 RCA。本研究結果為臨床使用HSYA防治心臟缺血性疾病提供理論依據。