MCU在高糖誘導心肌H9c2細胞凋亡中的作用機制*

鄭文學， 荊 哲， 郭文昀， 張 濤， 陳 霞， 吳兆琦， 崔恒強， 楊紅寧， 張玉秀， 惠 玲， 陳永清△

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院 1心血管內科， 2醫學實驗科， 甘肅 蘭州 730000)

糖尿病高血糖可導致心血管系統多種病理性改變，但有關高血糖對心肌細胞凋亡作用的機制研究仍然有限。近年來有研究發現線粒體鈣離子單向轉運體(mitochondrial calcium uniporter, MCU)通過依靠線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, Δψm)高選擇性地攝取Ca2+調節線粒體內游離鈣離子濃度(mitochondrial free Ca2+concentration, [Ca2+]m)穩態[1-2]。[Ca2+]m可以作用于線粒體三羧酸循環中丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase, PDH)進而影響線粒體能量代謝及功能[3-4]，而線粒體功能障礙和線粒體氧化應激增強引起心肌細胞凋亡是糖尿病心肌病發病的主要病理生理機制[5-7]。精胺(spermine, Sp)是MCU的激動劑，可能通過變構激活作用增加MCU對Ca2+的跨膜轉運[8-11]，在心肌細胞中精胺可通過激動MCU增加Ca2+向線粒體內轉運[12-13]。有研究表明高糖(high glucose,HG)培養的心肌細胞[Ca2+]m降低[14-15]，但是關于高糖培養的心肌細胞中MCU表達變化及[Ca2+]m穩態與心肌細胞凋亡之間的具體機制尚不清楚。

本研究采用高糖培養的大鼠心肌H9c2細胞模擬糖尿病高糖對心肌細胞損傷的病理過程，探討高糖通過降低MCU表達導致的活性下降促進心肌H9c2細胞凋亡的機制，以期為糖尿病心肌病的防治研究提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 細胞

心肌H9c2細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

2 主要試劑

DMEM細胞培養基和胰蛋白酶(HyClone)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；精胺、RIPA細胞裂解液、BCA蛋白含量測定試劑、PMSF、Ⅰ抗、ATP檢測試劑盒、JC-1檢測試劑盒、活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)檢測試劑盒、β-actin抗體和Ⅱ抗(上海碧云天生物技術有限公司)；Rhod-2 AM、MCU、caspase-9和caspase-3抗體(Abcam)；PDH活性檢測試劑盒(上海索寶生物科技有限公司)；TRIzol、引物合成、反轉錄試劑盒和熒光定量PCR檢測試劑盒(TaKaRa)。

3 主要方法

3.1細胞分組 細胞隨機分為3組：正常對照(control)組(5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇處理細胞)、HG組(25 mmol/L 葡萄糖處理細胞)和HG+Sp組(25 mmol/L葡萄糖+5 μmol/L精胺處理細胞)。各組細胞均在處理后于37 ℃、5% CO2細胞培養箱培養72 h。

3.2Western blot檢測細胞蛋白表達 RIPA裂解細胞，BCA法測定蛋白濃度并將其調整一致。各蛋白樣本取20 μg進行12%SDS-PAGE，然后轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別用MCU(1∶500)、caspase-9(1∶500)、caspase-3(1∶500)和β-actin(1∶500)Ⅰ抗4 ℃孵育過夜。洗膜后，用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgGⅡ抗(1∶3 000)室溫孵育膜1 h。洗膜后，超敏ECL化學發光法顯色。采用目的蛋白與內參照β-actin灰度值的比值反映蛋白的表達水平。

3.3RT-qPCR 檢測mRNA表達 TRIzol法提取細胞總RNA并反轉錄為cDNA后進行qPCR。MCU的上游引物序列為5’-GAGACTGAGAGACCCGCTACA-3’，下游引物序列為5’-AAGGCGTGAGTTACAAACAGG-3’；β-actin的上游引物序列為5’-AGCCATGTACGTAGCCATCCA-3’，下游引物序列為5’-TCTCCGGAGTCCATCACAATG-3’。反應條件為：94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s,60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，40個循環；72 ℃ 5 min，轉為4 ℃保存。反應在Rotor-Gene 300 Real-time PCR儀上進行；用Rotor-Gene 6.1 software分析數據。

3.4線粒體Ca2+濃度檢測 Rhod-2 AM工作液(2 μmol/L)覆蓋細胞，37 ℃細胞培養箱中孵育60 min，洗滌后，HBSS 溶液覆蓋細胞，37 ℃培養箱中孵育約30 min，熒光顯微鏡檢測細胞(激發波長545 nm)，熒光強度代表線粒體內Ca2+濃度。

3.5PDH活性檢測 按照PDH活性檢測試劑盒說明書進行操作，每200萬細胞加入400 μL提取液，超聲波破碎細胞(功率200 W，工作3 s，間歇10 s，工作35次)，12 000×g、 4 ℃離心30 min，取上清。PDH催化丙酮酸脫羧生成乙醛，添加乙醇脫氫酶進一步催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+，NADH在340 nm有吸收峰，通過測定340 nm光吸收下降速率，來計算PDH活性。

3.6ATP濃度的檢測 按照ATP檢測試劑盒說明書進行操作，6孔板每孔加入200 μL裂解液完全裂解細胞，12 000×g、4 ℃離心5 min，取上清。當螢光素酶和螢光素過量時，在一定范圍內熒光產生和ATP濃度成正比，根據標準曲線計算樣品中ATP濃度。

3.7線粒體膜電位的檢測 用PBS洗滌6孔板中的細胞1次，每孔分別加入1 mL細胞培養液和1 mL JC-1染色工作液，充分混勻。37 ℃細胞培養箱中孵育20 min。棄上清，用1×染色緩沖液洗滌2次，加入2 mL細胞培養液，熒光顯微鏡下觀察。當Δψm較高時，JC-1熒光探針聚集在線粒體的基質中形成聚合物(aggregates)，可以產生紅色熒光；當Δψm處于較低水平時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，JC-1單體(monomers)產生綠色熒光。用紅綠熒光相對比例的增減來反映Δψm的變化。

3.8活性氧簇檢測 MitoSOXTM染色法檢測心肌細胞線粒體ROS水平。按照1∶1 000用HBSS/ Ca2+/Mg2+稀釋MitoSOXTM，終濃度為5 μmol/L工作液。6孔板1孔中加入500 μL工作液，充分覆蓋細胞，另一個孔中加500 μL HBSS/Ca2+/Mg2+作為陰性對照，37 ℃避光孵育10 min。去除MitoSOXTM工作液，使用溫HBSS/Ca2+/Mg2+輕微清洗3遍。使用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照，用紅色熒光強度的相對比例來反映ROS水平。

4 統計學處理

數據采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，用均數±標準差(mean±SD)表示各組數據，兩組之間的比較采用非配對t檢驗，多組之間的比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 高糖培養的心肌H9c2細胞中MCU表達降低

Western blot結果顯示，與對照組比較，HG組和HG+Sp組H9c2細胞中MCU蛋白表達降低(P<0.05),見圖1A; RT-qPCR 檢測檢測結果顯示，與對照組比較，HG組及HG+Sp組MCU 的mRNA表達減低(P<0.05)，見圖1B。

2 激活MCU改善高糖誘導的線粒體鈣穩態失衡和代謝

Rhod-2 AM探針檢測[Ca2+]m結果顯示，HG組[Ca2+]m較對照組明顯降低(P<0.05)；與HG組相比，HG+Sp組[Ca2+]m升高(P<0.05)，見圖2。PDH活性檢測結果顯示，HG組H9c2細胞中PDH的活性顯著低于對照組(P<0.05)；與HG組相比，HG+SP組的H9c2細胞中PDH活性則顯著升高(P<0.05),見圖3A。ATP檢測試劑盒檢測結果顯示，HG組H9c2細胞的ATP濃度顯著低于對照組(P<0.05)；與HG組的相比，HG+SP組的ATP濃度顯著增加(P<0.05)，見圖3B。

Figure 1.Comparisons of the protein (A) and mRNA (B) expression of MCU among control group, HG group, and HG+Sp group. Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group.

圖1 各組心肌細胞中MCU蛋白及mRNA表達比較

Figure 2.Comparisons of [Ca2+]mamong control group, HG group, and HG+Sp group. Mean±SD.n=8.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsHG group.

圖2 各組H9c2細胞線粒體中[Ca2+]m的比較

3 激活MCU減低高糖誘導的線粒體功能損傷

JC-1活性檢測結果顯示，HG組H9c2細胞的Δψm顯著低于對照組，JC-1 monomers/aggregates比值升高(P<0.05)；與HG組相比，HG+Sp組的Δψm則顯著增加,JC-1 monomers/aggregates比值降低(P<0.05)，見圖4。MitoSOXTM染色法檢測心肌細胞線粒體的ROS水平，結果顯示HG組的ROS水平顯著高于對照組(P<0.05)；與HG組相比，HG+Sp組的ROS水平則顯著減低(P<0.05)，見圖5。

4 激活MCU減低高糖誘導的線粒體內源性細胞凋亡

Western blot結果顯示，與對照組相比，HG組H9c2細胞中caspase-9和caspase-3蛋白表達顯著增加(P<0.05)；與HG組相比，HG+Sp組的H9c2細胞中caspase-9和caspase-3蛋白表達顯著減少(P<0.05)，見圖6。

討 論

目前有關高血糖引起心肌細胞凋亡的作用機制還未明確。我們采用高糖條件下培養的大鼠心肌H9c2細胞模擬糖尿病高糖對心肌細胞損傷的病理過程。

Figure 3.Comparisons of pyruvate dehydrogenase (PDH) activity (A) and ATP content (B) among control group, HG group, and HG+Sp group. Mean±SD.n=8.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsHG group.

圖3 各組心肌細胞中PDH活性和ATP濃度比較

Figure 4.Comparisons of mitochondrial membrane potential among control group, HG group, and HG+Sp group. Mean±SD.n=8.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsHG group.

圖4 各組H9c2細胞Δψm水平的比較

Figure 5.Comparisons of mitochondrial ROS levels among control group, HG group, and HG+Sp group. Mean±SD.n=8.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsHG group.

圖5 各組H9c2細胞線粒體ROS水平的比較

Figure 6.Comparisons of caspase-3 and caspase-9 protein levels among control group, HG group, and HG+Sp group. Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsHG group.

圖6 各組H9c2細胞中caspase-3和caspase-9表達的比較

線粒體Ca2+攝取主要通過線粒體Ca2+單向轉運蛋白復合物(mitochondrial Ca2+uniporter complex, MCUC)實現，蛋白質MCU組成該復合物Ca2+跨膜轉運的孔道[1-2]。MCU通過依靠Δψm高選擇性地攝取Ca2+來調節[Ca2+]m穩態[1-2]。我們的研究表明高糖通過MCU表達降低導致的活性下降使[Ca2+]m減低，這與前期研究結果一致[16-17]。但是高糖通過MCU表達降低導致的活性下降使[Ca2+]m降低與高糖促使心肌細胞凋亡之間的機制還不清楚。

我們的研究結果顯示MCU表達降低導致的活性下降，促使線粒體PDH活性、細胞ATP濃度和Δψm降低，而線粒體ROS水平升高。精胺沒有影響MCU蛋白和基因的表達，精胺可能通過變構激活作用增加MCU對Ca2+的跨膜轉運[8-11]。同樣，心肌細胞中精胺可激動MCU增加線粒體[Ca2+]m[12-13]。[Ca2+]m可以激活線粒體基質中的幾種三羧酸循環中脫氫酶(包括PDH)，從而調節線粒體能量代謝及功能[3-4]。線粒體功能障礙和線粒體氧化應激增強引起心肌細胞凋亡是糖尿病心肌病發病的主要病理機制[5-7]。在高糖培養的心肌細胞中加入精胺后，我們觀察到線粒體[Ca2+]m、線粒體PDH活性、細胞ATP濃度和Δψm都顯著升高，而ROS水平降低，caspase-9和caspase-3凋亡蛋白表達減少。因此，我們的研究結果表明在高糖培養的H9c2細胞中恢復線粒體[Ca2+]m對依賴Ca2+的線粒體功能產生正向影響。恢復高糖培養的的H9c2細胞中[Ca2+]m穩態使線粒體PDH活性增加，細胞ATP濃度增加，線粒體膜電位升高，而ROS水平降低，可能是我們觀察到H9c2細胞凋亡減少的原因。

綜上所述，高糖通過降低MCU表達導致其活性下降可促進心肌H9c2細胞凋亡，其機制可能與線粒體的鈣離子穩態失衡、三羧酸循環障礙和線粒體功能損傷有關。