不同程度冠狀動脈粥樣硬化病變下心肌組織中melusin的表達研究*

李 竹， 萬昌武， 于燕妮， 黃 江， 夏 冰， 汪元河， 汪家文， 王 杰

(貴州醫科大學法醫學院， 貴州 貴陽 550004)

冠心病(coronary heart disease, CHD)指因冠狀血管病變導致心肌供血不足而引起的缺血性心臟病，是由于冠狀動脈病變導致血管結構性或功能性狹窄，使心肌供血不足，從而引起一系列心臟代謝、功能及結構的紊亂疾病。研究表明，CHD是心血管系統疾病中發病率最高的疾病，也是導致猝死最常見的疾病，對人類健康及生命構成了極大危害[1]。melusin蛋白是一種特異性的肌肉組織蛋白，屬于黏附分子的一員，其具有獨特的結構域，不僅介導了細胞與細胞外基質及其細胞自身的黏附，還參與了細胞的信號轉導與活化等重要的生理病理過程(生長、分化、炎癥反應及創傷修復等)[2]。研究表明，melusin在血管平滑肌細胞特別是在斑塊內微血管中存在，對冠狀動脈粥樣硬化中血管的形成具有顯著的調節作用[3-4]。動物實驗也證實，在動脈粥樣硬化早期，melusin的高表達可以引起粥樣斑塊的生長；同時其能幫助平滑肌細胞浸潤血管內膜從而促進新生血管的生成，在動脈粥樣硬化晚期可以防止斑塊破裂、出血[5]。在小鼠的左前降支冠狀動脈結扎模型中，melusin的表達發揮了重要的保護作用，不僅減少了炎癥細胞的浸潤，還改善了缺血遠端的冠脈痙攣及心肌組織的缺血狀態，有效防止了心臟破裂[6-7]。有研究報道，在動脈粥樣硬化患者的心肌中，melusin的蛋白及mRNA表達量較正常實驗者顯著降低[8-9]。由此可見，melusin作為一種保護性因子，參與了心血管系統疾病的發生，在冠狀動脈疾病，尤其是冠狀動脈粥樣硬化的發生發展過程中發揮了重要的作用。但上述研究結果來源僅限于動物模型、血清學等層面，關于直接檢測人體心臟組織中melusin表達的報道較為罕見。

本研究旨在通過收集法醫鑒定中冠心病案例，檢測心肌組織中melusin蛋白的表達水平，分析其在不同程度冠狀動脈粥樣硬化病變下的改變情況，探討melusin表達與冠心病發生發展的關系，為冠心病的早期預防和治療提供更為充分的實驗依據。

材 料 和 方 法

1 實驗材料收集

根據衛生部頒布的《解剖尸體規則》并獲得了貴州醫科大學倫理委員會的認可(倫審批件號：2018-60-01)，提取了貴州醫科大學法醫司法鑒定中心2014年5月～2018年10月經尸體解剖檢驗的人體冠狀動脈及心臟組織樣本，主要為左心室肌實驗組和對照組。實驗組案例納入標準：(1)納入的案例為常溫保存1 d或冰凍保存3 d以內(后于室溫解凍24 h)者；(2)經組織病理學檢查確認存在冠心病病變：①冠狀動脈管壁內膜增厚、管腔變窄，增厚的冠脈內膜見粥樣斑塊形成，存在或不存在繼發病變(粥樣斑塊破裂、斑塊內出血、動脈瘤形成等)；②合并心肌病變(心肌纖維化、心肌梗死等)；(3)冠狀動脈粥樣硬化伴有或不伴有心肌缺血改變；(4)冠心病伴有或無心臟肥大；(5)按WHO規定，猝死是指從癥狀發作至死亡時間在24 h內。實驗組案例排除標準：(1)組織自溶、腐敗，結構不清的病例；(2)尸體檢驗及組織病理學檢查證實有風濕性心臟病、心肌病、心肌炎等病變；(3)具有惡病質或多器官功能障礙及全身感染性炎癥的病例。對照案例納入標準：(1)納入的案例為常溫保存1 d或冰凍保存3 d以內(后于室溫解凍24 h)者；(2)死亡原因明確為意外高墜、機械性窒息死亡或溺死且無冠狀血管及心肌組織病變。排除標準同實驗組。

根據上述納排標準，對照案例選取無病變的冠狀動脈前降支及左心室肌；實驗組選取肉眼所見的冠狀動脈粥樣硬化病變最重(狹窄最重)血管段，經組織學檢查證實為粥樣硬化病變的案例，同時提取案例對應的左心室肌組織。所取組織均以4%中性甲醛液固定供HE染色和免疫組織化學(immunohistochemical staining，IHC)染色，其中部分心肌組織置于-80 ℃冰箱凍存供Western blot及real-time PCR檢測。

2 主要儀器與試劑

兔抗人melusin單克隆抗體(GeneTex)；兔抗人β-actin單克隆抗體(Bioss)；PV9000二步法試劑盒(中杉金橋)；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(Thermo)；SYBR? Select Master Mix試劑(Applied Biosystems)。顯微鏡(Olympus)；ND2000 超微量紫外分光光度計和ABI Fast 7500型實時熒光定量PCR儀(Thermo)。

3 主要方法

3.1心肌組織HE染色及形態觀察 經4%中性甲醛液固定的心肌組織，石蠟包埋后行4 μm切片，HE染色后于光鏡下觀察心肌的結構變化，并采集圖像。

3.2Western blot檢測人心肌組織內melusin蛋白的表達 取出-80 ℃冰箱凍存的心肌組織(重量70～90 mg)勻漿，提取蛋白。用紫外分光光度計測量其濃度，以β-actin為內參照，行SDS-PAGE分離(12% SDS膠濃度)。PVDF膜轉膜，5%脫脂牛奶封閉后孵育Ⅰ抗β-actin(1∶2 000)、melusin(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶10 000)Ⅱ抗，經過底物顯色后進行圖像采集，采用ImageJ軟件檢測各泳道的灰度值并分析。

3.3IHC染色檢測心肌組織內melusin蛋白的表達與分布 石蠟包埋的4 μm切片，脫蠟，水化，高壓熱修復抗原，以melusin抗體(1∶150)為Ⅰ抗，以PBS緩沖液為陰性對照，4 ℃孵育過夜。以辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG為Ⅱ抗，室溫孵育40 min，經DAB顯色2 min，蘇木素復染30 s后封片。于鏡下觀察陽性表達細胞的位置、強度后在400倍鏡下選取5個視野拍照，測量平均吸光度(陽性表達吸光度/測量總面積)以反應蛋白表達水平。

3.4real-time PCR測量心肌組織內melusin mRNA的表達量 采用TRIzol試劑提取心肌組織(70～90 mg)的總RNA。用紫外分光光度計對RNA進行定量，并進行逆轉錄。后加入熒光Mix試劑和引物在實時熒光定量PCR儀上測量Ct值，用2-ΔΔCt法計算mRNA表達量。PCR條件為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，共40個循環。解離曲線條件為：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。所得的引物均是在NCBI網站Gene庫中檢索，并按照引物設計原則設計，最后由上海生物工程有限公司合成的。引物序列見表1。

4 統計學處理

所得數據行正態分布及方差齊性檢驗。計量資料采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間均數比較采用單因素方差分析；計數資料組間比較采用卡方檢驗。利用logistic回歸對各個單變量與CHD的關系進行單因素分析，得出各個變量對CHD的優勢比(odds ratio, OR)和95%可置信區間(confidence interval, CI)；并采用廣義相加模型評估melusin的表達和CHD的相關性。數據均來自3次獨立實驗結果。使用SPSS 22.0統計學軟件分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

表1 Real-time PCR引物序列

結 果

1 光鏡下觀察并分組

按納排標準收集冠狀動脈及心肌組織，實驗組各70例，對照組(A組)各20例。光鏡下觀察冠脈內膜，以脂質壞死核心占斑塊面積的40%為標準[10]，進而根據斑塊內是否存在繼發病變將實驗案例分為：B組，動脈粥樣硬化斑塊穩定組；C組，粥樣硬化斑塊不穩定組但無血栓形成、斑塊破裂、斑塊內出血等任一種繼發病變者；D組，斑塊不穩定組且伴有上述任一種繼發病變者。分組依據見表2。

表2 分組的依據

In the case of secondary lesions, there is a single lesion or a combination of two or three secondary lesions.

2 病例基本情況

比較各組間基線資料，組間性別、身高、是否飲酒、是否有慢性呼吸系統疾病及慢性肝臟疾病等資料差異無統計學意義(P>0.05)；年齡、是否肥胖、心臟重量、左心室壁厚度、是否吸煙、是否有高血壓及慢性腎臟疾病等資料差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

3 冠狀動脈及心肌結構的病理變化

HE切片光鏡下可見對照組血管壁薄，內膜平滑完整；B、C、D組見血管壁偏心性增厚，管腔不同程度狹窄，內膜下見纖維帽形成，于壞死核心底部及周邊見泡沫細胞、淋巴細胞浸潤及大量薄壁小血管增生；部分病例出現典型粥樣壞死灶，壞死核心周邊殘留數量不等的泡沫細胞等炎癥細胞，病灶表面纖維帽厚薄不一；病灶內還可見斑塊內出血，血栓形成等繼發病變，血管中膜彈性纖維斷裂、平滑肌細胞受壓萎縮變薄，外膜可見結締組織增生及少量淋巴細胞浸潤,見圖1。

表3 案例的基線資料比較

BMI： body mass index.

Figure 1.Microscopic changes in coronary vascular structures (HE staining, ×40). A: control group; B: atherosclerosis but no sudden coronary death; C: sudden coronary death but coronary atherosclerotic lesions without secondary lesions; D： sudden coronary death and coronary atherosclerotic lesions associated with thrombosis.

圖1 冠狀動脈血管結構的顯微改變(HE染色)

HE切片光鏡下可見對照組心室肌細胞橫紋結構清晰，核橢圓且染色均勻，心肌纖維形態規則; B組見部分心肌細胞體積增大，胞核增大、深染，形態不規則；部分心肌細胞出現萎縮改變，核漿比相對增大，心肌纖維間隙增寬，橫紋模糊不清；C組可見心肌間質增寬，圍繞間質小血管的心肌出現纖維化改變；D組見部分心肌伴不同程度的脂肪組織浸潤，部分心肌于梗死灶的周邊部出現凝固性壞死，呈網狀分布，心肌細胞核消失，肌漿均質紅染，嗜酸性染色增強，間質水腫，心肌纖維部分溶解消失，細胞間可見散在的單核細胞和淋巴細胞浸潤等炎癥反應,見圖2。

Figure 2.Microscopic change in human myocardial tissue (HE staining, ×100).

圖2 人心肌鏡下病理變化(HE染色)

4 心肌組織內melusin蛋白的表達

Western blot結果顯示與對照組相比，B組心肌組織中melusin表達顯著升高(P<0.05)，C組中melusin水平較對照組比較明顯降低，且D組melusin水平明顯低于C組(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The result of Western blot for melusin. Mean±SD.*P<0.05vsA group;#P<0.05vsB group;△P<0.05vsC group.

圖3 melusin的Western blot結果

5 心肌組織melusin的表達水平

IHC染色結果表明，對照組心肌細胞胞漿中有分布均勻的棕黃色著色，B組心肌細胞中棕黃色著色細胞顏色增深；C組中棕黃色染色的心肌細胞數量明顯減少，著色變淡；而D組的心肌細胞胞漿中部分未見棕黃色顆粒的陽性表達，melusin表達顯著減弱，陽性染色呈點片狀分布，部分心肌可見大片缺染及淡染的情況，見圖4。

用IPP 6.0軟件分析檢測melusin表達的平均吸光度，與對照組比較，B組陽性表達明顯增高，C組和D組陽性表達顯著降低(P<0.05)，見圖4。

6 心肌組織內melusin mRNA的表達

real-time PCR結果顯示，B組中melusin mRNA的水平與對照組比較有顯著升高(P<0.05)；C組mRNA水平較對照組明顯降低，D組melusin mRNA水平較C組減少(P<0.05)，見圖5。

7 logistic回歸和多元回歸分析

各變量與CHD發病關系的回歸分析結果顯示，年齡、心臟重量、是否肥胖、是否吸煙、是否有高血壓為CHD發生的危險因素；而melusin的表達是CHD發病的保護因素,見表4。在調整了各變量后，廣義相加模型結果顯示melusin的表達與CHD的發病密切相關，呈現顯著的負相關性(OR=0.3； 95% CI: 0.2～0.4；P<0.01)。

Figure 4.Expression of melusin protein in human myocardial tissues (IHC staining,×400). Mean±SD.*P<0.05vsA group;#P<0.05vsB group;△P<0.05vsC group.

圖4 人心肌組織melusin蛋白表達的IHC結果

Figure 5.The melusin mRNA expression in heart tissues. Mean±SD.*P<0.05 A groups;#P<0.05vsB group;△P<0.05vsC group.

圖5 各組melusin mRNA相對表達量

討 論

研究表明，心源性猝死是法醫病理猝死案件中最常見的類型[1]，其中冠心病性猝死位居第1位，約占心源性猝死的50%[11]。CHD是指因冠狀血管病變導致心肌供血不足而引起的缺血性心臟病，缺血程度較輕者可沒有明顯不適或僅表現為心絞痛，程度較重者可因發生心肌梗死而危及生命，缺血程度嚴重者則會因心臟功能嚴重紊亂致短時間內死亡，即猝死。引起CHD發作的原因較多，其中以冠狀動脈粥樣硬化最為多見。由于冠脈內膜下脂質沉積、纖維組織增生及粥樣壞死灶的形成等，使得病變部位血管壁出現不同程度增厚、彈性降低，管腔出現不同程度狹窄等改變，致使心肌供血不足從而引起CHD發作。

表4 logistic回歸分析結果

Melusin is the correction factor.MA: mean absorbance.

Melusin蛋白是由基因ITGB1BP2(Xq12～q13) 編碼的一種特異性肌肉組織蛋白，在骨骼肌和心肌中特異性的高表達。其作為整合素β1的功能性伴侶蛋白和支架蛋白，使細胞與細胞外基質的變化相互傳導，讓細胞能夠更好的適應環境變化，從而維持細胞基本功能，提高生存適應性[7]。諸多研究證實，在正常生理條件下，心臟的發育和基礎功能均不受melusin的影響[12]，但在出現主動脈瓣狹窄、冠狀動脈粥樣硬化、高血壓等病理改變后，其表達增高可以維持心臟正常的節律性和收縮性，保持心臟形態，防止心室擴張并向心力衰竭過渡[13]。在小鼠冠狀動脈粥樣硬化模型中，melusin的存在不僅能減少炎細胞的浸潤，還可以改善缺血遠端的冠脈痙攣及心肌的狀態，防止心臟發生破裂[6-7]，以上研究表明melusin作為一種保護性因子，參與了心血管系統疾病的發生，能夠有效的減少心肌細胞凋亡，維持心臟的正常結構和生理功能，在冠狀動脈疾病，尤其是冠狀動脈粥樣硬化的發生發展過程中發揮了積極的保護效應。

研究表明，melusin的高表達可以誘導心肌肥大，適度增加左心室壁厚度而不改變收縮功能，并且阻止進一步向擴張型心肌病和心力衰竭過渡，同時也可使遠端缺血區域的存活心肌組織缺血情況有所改善[6]。本研究檢測了不同程度冠狀動脈粥樣硬化病變下心肌組織中melusin的表達改變，發現在粥樣硬化病變輕、心肌缺血程度較輕者的心肌中，melusin表達量增加，心肌細胞呈現出肥大改變。但在粥樣硬化病變、心肌缺血嚴重的患者心肌中，我們檢測到melusin表達量顯著降低，甚至消失。同時我們將收集的各變量與CHD發病關系進行logistic回歸分析，得到melusin蛋白在心肌組織中的表達和CHD發病呈顯著負相關性，這提示melusin作為CHD發病的一種保護因素，可能通過調節某種信號轉導通路，如PI3K/AKT及MAPK信號通路等[14-15]，減少了炎癥細胞的浸潤及纖維化，使心肌細胞凋亡減少，免受氧化應激的誘導，從而發揮保護心肌細胞的作用；而melusin含量的減少可能影響了上述信號通路對心肌組織的保護調節作用，進而加速病程的進展。但對其所影響的具體信號通路及機制還有待于進一步探討。

此外，本研究還存在一定的局限性。首先，本研究資料統計屬于回顧性研究，難以追溯缺失的基礎資料，如血脂、血壓、血糖等無法測量[16]，所以無法對這類因素與CHD發病之間的相關性作出評估；其次，本研究的樣本量有限，可能存在選擇偏倚。

綜上所述，在不同程度冠狀動脈粥樣硬化病變下心肌組織中melusin的表達差異顯著，且與冠心病的發生發展呈負相關，提示melusin可能是冠心病發生發展過程中心臟的保護因素。