3D打印骨科鈦合金的亞慢性全身毒性研究

王涵 趙丹妹 許建霞 連環 曲明悅 何牧野 王春仁

3D打印技術又稱為增材制造技術或快速成型技術，已廣泛應用于醫療器械領域。就鈦合金植入物而言，目前我國已有3D打印鈦合金植入物獲得CFDA的注冊許可證，更多的增材制造醫用鈦合金植入物也逐步進入醫療器械注冊審評環節[1]。

3D打印骨科植入物作為長期植入體內的醫療器械產品，存在體液環境中微粒析出、動態環境中材料脫落等風險，對其進行合理的臨床前安全性評價很重要[2]。本研究對3D打印的骨科鈦合金的亞慢性全身毒性進行研究，以判斷其是否具有潛在的亞慢性全身毒性，為相關的臨床研究和應用提供毒理學數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

SPF級SD大鼠，4～5周齡(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源中心)，適應性喂養5 d后用于實驗。大鼠獨立通氣籠(IVC)條件下飼養，飼養密度2只/籠，換氣次數大于50次，籠盒內風速小于0.2 m/s，室溫20 ℃～25 ℃，相對濕度40%～70%。光照采用自動定時方式控制12 h光照12 h黑暗。實驗動物生產許可證號：SCXK(京) 2014-0013；實驗動物使用許可證號：SYXK(京) 2017-0013；飼料生產許可證號：京飼證(2014)06054。

1.1.2試劑與儀器

生化檢測試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；凝血酶原時間PT檢測試劑盒、活化部分凝血活酶時間APTT檢測試劑盒、血液學檢測試劑盒(希森美康醫用電子有限公司，日本)；水合氯醛、檸檬酸三鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；0.9%氯化鈉注射液、甲醛(石家莊四藥股份有限公司)。

HITACHI 7080全自動生化分析儀、低溫離心機(日立公司，日本)，Sysmex CA 1500全自動凝血分析儀、Sysmex XT-1800i全自動血液分析儀(希森美康醫用電子有限公司，日本)，顯微鏡(萊卡公司，德國)，電子天平(上海躍平科學儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1試驗樣品

3D打印骨科鈦合金試樣(國產；規格：6×10×30)，輻照滅菌。

1.2.2樣品浸提液制備

采用0.9%NaCl注射液按0.2 g/mL比例制備浸提液，在37 ℃下振搖浸提72 h。用同批號浸提介質作為陰性對照。

1.2.3試驗步驟

注射前隨機將大鼠分為對照組和試驗組，每組20只，雌雄各半。試驗組大鼠尾靜脈注射檢測樣品浸提液，對照組大鼠尾靜脈注射浸提介質，每天注射1次，注射量為10 mL/Kg，共注射28 d。根據大鼠體重增長情況調整檢測樣品浸提液注射體積。28 d后解剖，解剖前禁食16 h，稱取空腹體質量，10%水合氯醛溶液以0.4 mL/100 g BW大鼠腹腔注射麻醉后，下腔靜脈取血，分別測定血液學、血液生化學各項指標；放血處死大鼠，解剖觀察各組織器官是否出現異常，稱取各臟器濕重值，計算各組織器官的臟器系數(g/100 g)，浸泡在10%甲醛溶液固定后進行常規組織病理學檢查。

1.2.4檢測指標

試驗結束日，麻醉后下腔靜脈取血。測定血紅蛋白濃度(HGB)、紅細胞數(RBC)、血小板數(PLT)、白細胞數(WBC)和凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)等血液學指標；血液經離心分離血清，測定天門冬氨酸氨基轉換酶(AST)、丙氨酸氨基轉換酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素(UREA)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、肌酐(CRE)、總膽固醇(T-CHO)等臨床生化指標。大鼠處死后系統尸解，稱取腦、心、肝、脾、腎、腎上腺、胸腺、睪丸、附睪、子宮、卵巢的質量并計算臟器系數(g/100 g)。

1.3 統計學方法

以SPSS 21.0軟件進行統計學分析。若兩組樣本方差齊性且符合正態分布，選擇兩獨立樣本t檢驗；若方差不齊選用兩樣本秩和檢驗。P<0.05表示兩組間差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般狀況觀察

對照組和樣品組大鼠外觀及行為正常，活動自如，呼吸均勻，心跳勻速，反應敏捷，被毛潤澤，皮膚和黏膜無改變，眼、耳、鼻、口、生殖腺和肛門無異常分泌物，糞便軟、色棕黃、成型。每日觀察未見大鼠出現明顯異常反應或瀕死狀態。

2.2 對體質量的影響

各時間點樣品組與對照組大鼠體質量差異無統計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 大鼠體質量

2.3 血細胞

雄性大鼠樣品組淋巴細胞數(L)與同性別對照組有顯著統計學差異(P<0.05)；其余各指標雌雄樣品組與對照組差異無統計學意義(P>0.05)(表2)。

表2 大鼠血液學數據

*：與同性別對照組比較，P<0.05

*: Compared with the control group of the same sex,P<0.05

2.4 臨床生化

雄性大鼠樣品組天門冬氨酸氨基轉換酶(AST)、肌酐(CRE)與同性別對照組有顯著統計學差異(P<0.05)；雌性大鼠樣品組甘油三酯(TG)與同性別對照組差異顯著(P<0.05)；其余各指標雌雄大鼠樣品組與對照組差異無統計學意義(P>0.05)(表3)。

表3 大鼠血生化數據

*：與同性別對照組比較，P<0.05

*: Compared with the control group of the same sex,P<0.05

2.5 大鼠解剖觀察

解剖過程中未發現與試驗材料相關的肉眼可見的器官組織病變。

2.6 對臟器濕重的影響

雄性大鼠脾及腎上腺臟器質量與同性別對照組有顯著統計學差異(P<0.05)；其余臟器雌雄大鼠樣品組與對照組差異無統計學意義(P>0.05)(表4)。

表4 大鼠臟器濕重數據

2.7 對臟器系數的影響

雄性大鼠腎上腺臟器系數值與同性別對照組有顯著統計學差異(P<0.05)；其余指標雌雄大鼠樣品組與對照組差異無統計學意義(P>0.05)(表5)。

表5 大鼠臟器系數數據

*：與同性別對照組比較，P<0.05

*: Compared with the control group of the same sex,P<0.05

2.8 組織病理學檢查結果

對照組及樣品組個別動物出現了輕度肝細胞脂肪變性、肺輕度間質炎癥、輕度慢性間質性腎炎，其余各組織臟器未見明顯異常。兩組均有個別動物出現上述病變，不考慮為樣品的毒性反應。

3 結論

SD大鼠靜脈注射樣品浸提液28 d后，經各項指標檢測，與浸提介質對照組比較，有統計學差異但無臨床意義的指標如下：

①雄性大鼠樣品組淋巴細胞數(L)與同性別對照組有顯著統計學差異(P<0.05)。但這些值均在本實驗室參考值范圍內，不考慮為毒性反應。

②雄性大鼠樣品組天門冬氨酸氨基轉換酶(AST)、肌酐(CRE)與同性別對照組有顯著統計學差異(P<0.05)；雌性大鼠樣品組甘油三酯(TG)與同性別對照組有顯著統計學差異(P<0.05)。但這些值均在本實驗室參考值范圍內，不考慮為毒性反應。

③雄性大鼠脾及腎上腺臟器質量與同性別對照組有顯著統計學差異(P<0.05)，雄性大鼠腎上腺臟器系數值與同性別對照組有顯著統計學差異(P<0.05)。但這些值均在本實驗室參考值范圍內，不考慮為毒性反應。

本試驗結果表明，該檢測樣品未顯示出具有臨床意義的異常指標或毒性靶器官。

4 討論

3D打印骨科鈦合金植入物作為長期植入體內的醫療器械產品，除其治療的精準性、有效性之外，其安全性同樣值得關注。目前，我們進行3D打印植入物的生物相容性評價時，還是按照GB/T 16886系列標準進行評價。本研究通過SD大鼠尾靜脈注射途徑進行了3D打印骨科鈦合金的亞慢性毒性試驗。本試驗中樣品浸提介質為生理鹽水，連續給樣時間為28 d，通過對大鼠體質量、血液學、臨床生化、臟器系數、組織病理學檢測等指標綜合分析，未檢測到該樣品的亞慢性全身毒性。但本試驗中只檢測了試驗樣品生理鹽水(極性介質)浸提液，還可參照ISO 10993.11-2017中的胃腸外雙途徑接觸試驗方法，綜合評價該樣品極性及非極性可瀝濾物同時接觸人體時產生重復接觸全身毒性的可能性。

對3D打印醫療器械來說，需從數據和軟件、原材料、工藝穩定性等方面進行控制及標準化，以實現對其全過程的控制，才能確保最終的產品質量[3-4]。FDA關于增材制造的指導原則《Guidance for Industry and Food and Drug Administration Staff》于2017年12月發布[5]，目前國家藥品監督管理局醫療器械技術審評中心已制定《定制式增材制造醫療器械注冊技術審查指導原則》，其他增材制造相關的醫療器械注冊審查指導原則也在陸續編寫過程中。