高壓脈沖電場協(xié)同酶法輔助提取玫瑰 精油工藝優(yōu)化

周亞軍，李圣橈，王淑杰，薛長美，姚光明

（1.吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130062；2.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林 長春 130025；3.盤錦牙博士口腔門診部，遼寧 盤錦 124000）

玫瑰資源遍布世界各地，是集觀賞、美容、醫(yī)療、食用、藥用等多方面用途于一身的芳香草本植物。玫瑰花中含有多種天然活性物質(zhì)，如玫瑰精油、色素等[1-2]，玫瑰果中含豐富的VC[3]，其中玫瑰精油的應(yīng)用最為廣泛，它由幾十種芳香化合物組成[4]，具有抗氧化[5]、抗菌[6]和抗抑郁[7]等特點(diǎn)。在國際上玫瑰精油主要因其產(chǎn)量較低，價(jià)格高昂[8-9]被譽(yù)為“液體黃金”，因此，研究玫瑰精油的高效提取方法具有實(shí)際意義。

玫瑰精油的常規(guī)提取方法之一是水蒸氣蒸餾，此法操作簡單，應(yīng)用廣泛，但產(chǎn)量較低[10]。近來酶技術(shù)已經(jīng)逐漸被用來提取植物中有效成分[11-12]，而且早有研究表明酶輔助處理可增加油料溶出[13]。高壓脈沖電場（high intensity pulsed electric field，PEF）技術(shù)是一種非熱處理技術(shù)，最初被用于食品殺菌[14]。隨著研究的深入，PEF技術(shù)逐漸被應(yīng)用于天然成分的提取[15-16]。其原理是利用電穿孔作用將流經(jīng)兩個(gè)電極之間的液體樣品細(xì)胞破壞，使胞內(nèi)活性成分流出。Zhou Yajun等[15]利用PEF提取藍(lán)莓廢棄物中花色苷；Medina-Meza等[17]對比超聲波和PEF提取李子和葡萄皮中的活性物質(zhì)；王文淵等[18]利用PEF協(xié)同酶法提取竹葉中茶多酚和多糖；但利用PEF協(xié)同酶法輔助提取玫瑰精油的報(bào)道較少。在本研究中，將PEF和纖維素酶協(xié)同處理方法用于玫瑰精油的輔助提取并對工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，為玫瑰精油的高效提取提供了一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰花瓣（大馬士革品種，采自吉林長白山），于早5:00～7:00采摘后瀝干水分，貯存于-20 ℃冰箱中，備用。

纖維素酶（50 U/mg） 上海源葉生物科技有限公司；氯化鈉、無水乙醚、無水硫酸鈉（均為分析純） 北京化工廠；正己烷（色譜純） 濟(jì)寧恒泰化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BCD-266SN型冷藏冷凍箱 合肥美菱股份有限公司； JJ3003A電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司； WFB-HS0101智能破壁機(jī) 江門市西屋廚房小家電有限公司；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；PHSJ-4A pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；PEF裝置 長春華迪生物科技開發(fā)有限公司；揮發(fā)油提取裝置 長春 應(yīng)化所；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠； GC/MS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

取100 g冷凍玫瑰花瓣，加入一定比例蒸餾水打漿，備用。

1.3.2 水蒸氣蒸餾提取玫瑰精油

參照文獻(xiàn)[19]的方法，提取條件：料液比為1∶6（g/mL），10%氯化鈉，蒸餾4 h。按照式（1）計(jì)算玫瑰精油得率：

1.3.3 酶法輔助提取玫瑰精油實(shí)驗(yàn)

向玫瑰花勻漿中加入適量纖維素酶，調(diào)節(jié)水浴鍋溫度和pH值，開始酶解實(shí)驗(yàn)。結(jié)束后按照1.3.2節(jié)中方式提取。分別研究蒸餾時(shí)間和酶處理?xiàng)l件對玫瑰精油得率的影響。單因素試驗(yàn)水平如表1所示。

表 1 酶法輔助提取單因素試驗(yàn)水平Table 1 Codes and levels of enzyme-assisted distillation extraction parameters used for one-factor-at-a-time design

1.3.4 PEF協(xié)同酶法輔助提取玫瑰精油

1.3.4.1 PEF協(xié)同酶法輔助提取方案

由于玫瑰精油得率可能受PEF和酶處理順序的影響。此外，經(jīng)過PEF處理，可能會縮短酶解時(shí)間。所以設(shè)計(jì)2 種方案：1）先酶解：酶→PEF→水蒸氣蒸餾；2）后酶解：PEF→酶→水蒸氣蒸餾。分別測定2 種方案在不同酶解時(shí)間條件下的玫瑰精油得率。

1.3.4.2 PEF協(xié)同酶法輔助提取

根據(jù)酶法輔助提取和PEF協(xié)同酶法輔助提取玫瑰精油實(shí)驗(yàn)方案，選取適宜的酶解條件和協(xié)同輔助提取方法，分別研究蒸餾時(shí)間和不同電場處理?xiàng)l件對玫瑰精油得率的影響。單因素試驗(yàn)水平見表2。

表 2 PEF協(xié)同酶法輔助提取單因素試驗(yàn)水平Table 2 Codes and levels of PEF followed by enzyme-assisted distillation extraction parameters used for one-factor-at-a-time design

1.3.5 不同輔助提取方法對比實(shí)驗(yàn)

在適宜提取條件下，對比水蒸氣蒸餾提取、酶法輔助提取和PEF協(xié)同酶法輔助提取3 種方法的精油得率及所用時(shí)長。

1.3.6 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)不同輔助提取方法對比實(shí)驗(yàn)，選擇最優(yōu)提取方案，以玫瑰精油得率為響應(yīng)值，選取對精油得率影響最顯著的因素，基于Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化玫瑰精油提取的工藝參數(shù)。

1.3.7 玫瑰精油成分分析

參考文獻(xiàn)[20-21]方法，對最優(yōu)提取條件下的玫瑰精油進(jìn)行GC-MS成分分析。

1.3.7.1 色譜條件

色譜柱：HP-5MS石英毛細(xì)管柱；升溫程序：60 ℃保持1 min、以10 ℃/min升至100 ℃，保持8 min、以5 ℃/min 升至2 3 0 ℃，保持2 0 m i n；載氣（H e），流速為 1.0 mL/min；壓力15 psi；進(jìn)樣量1 μL，無分流。

1.3.7.2 質(zhì)譜條件

電子電離源；電子能量70 V；離子源溫度200 ℃；接口溫度為250 ℃；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 30～500。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值，采用Origin 8.1繪制單因素圖像，采用Design-Expert 8.6.0設(shè)計(jì)3因素3水平Box-Behnken優(yōu)化試驗(yàn)，各組樣品之間的差異采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶法輔助提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖1a可知，隨蒸餾時(shí)間延長，精油得率先逐漸增加后略微下降，3.0 h最大。這是由于蒸餾時(shí)間的延長使芳香成分逐漸釋放，但達(dá)到一定時(shí)間后，部分芳香成分因蒸餾過久受到破壞，精油得率下降。因此，選擇適宜的蒸餾時(shí)間為3.0 h。

從圖1b可以看出，精油得率隨著酶解時(shí)間延長而顯著增加，在酶解120 min時(shí)，精油得率最大，之后增加不明顯。可能原因是反應(yīng)前期，底物充足，酶解速率快，精油得率升高明顯；隨著反應(yīng)時(shí)間延長，底物減少直至全部被酶解或酶解產(chǎn)物抑制了酶解反應(yīng)，使精油得率不再增加。這與Sowbhagya等[22]的研究結(jié)果趨勢基本一致。因此，選擇適宜的酶解時(shí)間為120 min。

由圖1c可知，精油得率隨著酶解溫度的升高先上升后下降，在45 ℃時(shí)達(dá)到最大。這是因?yàn)殡S著溫度升高，酶的活性增加，當(dāng)溫度超過一定限度，酶的活性受到抑制，反應(yīng)速率降低，精油得率下降。這與李曉等[23]的研究結(jié)果趨勢基本一致。因此，選擇適宜的酶解溫度為45 ℃。

由圖1d可知，隨著pH值的升高，精油得率先上升后下降，在pH值為4.5時(shí)最大，這是因?yàn)樵谧钸mpH條件下，酶的活性較高，酶促反應(yīng)劇烈，最大限度地促進(jìn)玫瑰精油成分的溶出；而高于或低于最適pH環(huán)境都會抑制酶的活性，降低精油得率。這與孟利娜等[24]的研究結(jié)果趨勢基本一致。因此，選擇適宜的酶解pH值為4。

從圖1e可以看出，隨加酶量的增加，玫瑰精油得率先增加后變化平穩(wěn)，當(dāng)加酶量為0.06%時(shí)，玫瑰精油得率最大。這是因?yàn)榧尤氲睦w維素酶逐漸酶解花瓣細(xì)胞壁，使其結(jié)構(gòu)破壞，釋放出揮發(fā)性成分；當(dāng)酶與花瓣細(xì)胞壁全部結(jié)合后，精油釋放量趨于穩(wěn)定。Nguyen等[25]的研究也表明酶添加量過多會對細(xì)胞壁分解產(chǎn)生不利影響。因此，選擇適宜的加酶量為0.06%。

圖 1 蒸餾時(shí)間和酶處理?xiàng)l件對精油得率的影響Fig. 1 Effect of distillation time and enzyme treatment conditions on the yield of rose essential oil

2.2 PEF協(xié)同酶法輔助提取玫瑰精油實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 協(xié)同處理方式對玫瑰精油得率的影響

圖 2 協(xié)同處理方式對玫瑰精油得率的影響Fig. 2 Effect of synergistic treatments on the yield of rose essential oil

由圖2可知，隨酶解過程的進(jìn)行，當(dāng)酶解時(shí)間小于90 min時(shí)，兩種處理方式下精油得率均快速升高。酶解時(shí)間大于90 min后，先酶解處理的精油得率升高速率減緩甚至幾乎不變，后酶解處理的精油得率緩慢下降。后酶解精油得率在酶解90 min時(shí)有最大值且均大于先酶解精油。原因可能是，經(jīng)過PEF處理后，玫瑰勻漿分散更加均勻，有利于酶與其接觸反應(yīng)，精油得率更高；另一方面，PEF處理可能對酶有激活作用，提高其活性，促進(jìn)酶解效果。田美玲[26]的研究發(fā)現(xiàn)PEF處理能明顯提高α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和果膠酶的活性。因此，選擇酶解90 min，先PEF處理后酶解的方式。

2.2.2 蒸餾時(shí)間和PEF處理?xiàng)l件對玫瑰精油得率的影響

由圖3a可知，隨蒸餾時(shí)間的延長，精油得率先升高后緩慢降低，蒸餾時(shí)間為1.5 h時(shí)達(dá)到最大。其原因是蒸餾初期，花瓣細(xì)胞中芳香成分沒有完全溶出，精油得率不斷增加，但蒸餾時(shí)間過長會破壞熱敏成分，降低精油得率。因此，選擇適宜蒸餾時(shí)間為1.5 h。

由圖3b可知，精油得率隨著脈沖數(shù)的增大呈先上升后下降的趨勢，脈沖數(shù)為10時(shí)取得最大值。其原因可能是隨著脈沖數(shù)逐漸增大，脈沖頻率逐漸增加，PEF對玫瑰勻漿的作用時(shí)間相對延長，一方面激活了酶的活性，促進(jìn)酶解反應(yīng)，另一方增加了細(xì)胞破壞程度，兩方面原因同時(shí)促進(jìn)活性成分釋放。但當(dāng)脈沖數(shù)達(dá)到最大值后，較強(qiáng)的電場作用可能破壞了有效成分的結(jié)構(gòu)和酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，降低酶解反應(yīng)速率，從而降低精油得率。這與Zhou Yajun等[27]的研究結(jié)果趨勢相似。因此，選擇適宜的脈沖數(shù)為10 個(gè)。

由圖3c可知，精油得率隨電場強(qiáng)度的增加呈先增大后減小的趨勢，電場強(qiáng)度20 kV/cm時(shí)取得最大值，這是因?yàn)殡妶瞿軌蚴辜?xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生場強(qiáng)差，從而產(chǎn)生極化作用使細(xì)胞破壞，隨著電場強(qiáng)度的增加，細(xì)胞破壞程度越大，更利于與酶接觸反應(yīng)。此外，較低的電場強(qiáng)度激活了酶的活性，使精油得率增加，但當(dāng)電場強(qiáng)度超過一定限度后，可能會鈍化纖維素酶的活性，影響酶解效果，Zhang Ruobing等[28]的研究也認(rèn)為PEF有鈍化酶的作用；而且，過大電場強(qiáng)度可能對芳香成分有所破壞，導(dǎo)致精油得率降低，這與Wang Ke等[29]和He Guidan[30]的研究結(jié)果趨勢相似。因此，選擇適宜電場強(qiáng)度為20 kV/cm。

圖 3 蒸餾時(shí)間及PEF處理?xiàng)l件對玫瑰精油得率的影響Fig. 3 Effects of distillation time and PEF treatment conditions on the yield of rose essential oil

2.3 不同方法提取玫瑰精油對比實(shí)驗(yàn)分析

在適宜條件下，不同提取方法對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。從精油得率角度看，水蒸氣蒸餾提取玫瑰精油得率在0.081 0%左右。酶法輔助提取精油得率在0.096 7%左右，比水蒸氣蒸餾提取提高了約19.38%。PEF協(xié)同酶法輔助提取精油得率在0.116 5%左右，比水蒸氣蒸餾提取和酶法輔助提取分別提高了約43.83%和20.48%。從時(shí)間角度看，水蒸氣蒸餾提取總用時(shí)為4 h。酶法輔助提取總用時(shí)為5 h，比水蒸氣蒸餾多25%，表明酶法輔助提取雖然能夠較為明顯的提高精油得率，但耗時(shí)較長。PEF協(xié)同酶法輔助提取總用時(shí)約為3 h，分別比水蒸氣蒸餾提取和酶法輔助提取節(jié)省25%和40%。與單獨(dú)酶法輔助提取相比，PEF處理同時(shí)縮短了酶解時(shí)間和蒸餾時(shí)間，這是因?yàn)镻EF處理，先破壞了花瓣細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使其更有利于與酶接觸反應(yīng)，導(dǎo)致酶解時(shí)間減少，而細(xì)胞壁的破壞使蒸餾時(shí)間縮短。因此，PEF協(xié)同酶法能顯著增加玫瑰精油得率并縮短提取時(shí)間，是一種玫瑰精油高效提取方法。

表 3 不同提取方法對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Comparison of different extraction methods

2.4 PEF協(xié)同酶法輔助提取玫瑰精油工藝優(yōu)化

以電場強(qiáng)度（A）、脈沖數(shù)（B）、蒸餾時(shí)間（C）為試驗(yàn)因素，玫瑰精油得率為響應(yīng)值，基于Box-Behnken設(shè)計(jì)3因素3水平優(yōu)化試驗(yàn)，設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表 4 Box-Behnken試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 4 Box-Behnken design with experimental results

利用Design-Expert 8.6.0進(jìn)行電場強(qiáng)度、脈沖數(shù)和蒸餾時(shí)間對玫瑰精油得率的回歸分析，建立二次多項(xiàng)回歸方程：

二次回歸模型顯著性檢驗(yàn)與方差分析結(jié)果如表5所示。模型F值為146.74，P＜0.000 1，說明回歸方程模型極顯著；失擬項(xiàng)P值為0.145 6＞0.05，失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著，方程可以預(yù)測響應(yīng)值。模型的相關(guān)系數(shù)R2較高，為0.994 7，說明響應(yīng)值與自變量之間有較高的擬合度，線性關(guān)系顯著，可對試驗(yàn)進(jìn)行理論預(yù)測。R2Adj為0.987 9，說明試驗(yàn)值與回歸方程擬合度高，可以很好的對響應(yīng)值變化進(jìn)行解釋。因此，此模型可以用來優(yōu)化PEF協(xié)同酶法輔助提取玫瑰精油工藝。電場強(qiáng)度和蒸餾時(shí)間的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)，脈沖數(shù)的二次項(xiàng)，電場強(qiáng)度和蒸餾時(shí)間、脈沖數(shù)和電場強(qiáng)度的交互作用顯著。

表 5 回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance of regression model

圖4是電場強(qiáng)度、蒸餾時(shí)間和脈沖數(shù)3 個(gè)因素兩兩交互作用圖，其中電場強(qiáng)度和蒸餾時(shí)間、脈沖數(shù)和電場強(qiáng)度的交互作用顯著，3D效果圖的中心區(qū)域凸起，表示出現(xiàn)較高的精油得率，并由中心向兩邊逐漸減小。通過Design-Expert 8.6.0軟件分析得出最佳工藝參數(shù)：蒸餾時(shí)間1.64 h、電場強(qiáng)度20.96 kV/cm、脈沖數(shù)10.09 個(gè)，玫瑰精油理論預(yù)測值為0.116 3%。對最優(yōu)生產(chǎn)條件進(jìn)行實(shí)際調(diào)整，即蒸餾時(shí)間1.7 h、電場強(qiáng)度21 kV/cm、脈沖數(shù)10 個(gè)。通過3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，精油得率為0.116 5%，接近預(yù)測值。說明響應(yīng)面法優(yōu)化PEF協(xié)同酶法輔助提取玫瑰精油的參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

圖 4 各因素交互作用的響應(yīng)面與等高線圖Fig. 4 Response surface and contour plots showing interactive effects of various factors on the yield of rose essential oil

2.5 玫瑰精油成分分析

對PEF協(xié)同酶法輔助提取玫瑰精油的化學(xué)成分進(jìn)行GC-MS分析，總離子流圖見圖5，成分分析結(jié)果如表6所示。

圖 5 玫瑰精油GC-MS總離子流圖Fig. 5 Total ion chromatogram of the rose essential oil analyzed by GC-MS

表 6 玫瑰精油化學(xué)成分Table 6 Chemical composition of the rose essential oil

續(xù)表6

經(jīng)過GC-MS分析共鑒定出63 種成分，占精油總量的95.04%。其中萜烯類共23 種，醛類共8 種，醇類共13 種，烷烴類共6 種，酯類共6 種以及其他化合物。含量最高的成分是香茅醇（31.25%），其次是十九烷（11.34%），二者是精油的主要芳香成分。其他含量較高的成分還有香葉醇（9.14%）、橙花醇（2.53%）、乙酸香茅酯（3.64%）、芳樟醇（3.14%）、苯乙醇（2.27%）、乙酸香葉酯（1.55%）等，這些豐富的醇類及其酯類構(gòu)成了玫瑰精油的主體香氣成分[31]。此外，對化妝品中呈香物質(zhì)有較高價(jià)值的甲基丁香酚（1.37%）也被檢測出[32]。精油中還檢測出多種相對含量小于1%的芳香成分，這與文獻(xiàn)[33]結(jié)果相似，這些微量芳香成分對玫瑰精油綜合質(zhì)量具有重要影響。從水蒸氣蒸餾提取的精油中共鑒定出44 種成分，占精油總量的86.74%。由萜烯類、醛類、酮類、醇類、醚類、酚類和其他化合物組成。25 種化合物占比1%以上，其中主要為芳樟醇（4.40%）、香茅醇（2.68%）、香葉醛（1.31%）、橙花醛（1.82%）、丁香酚（3.02%）、甲基丁香酚（7.6%）、乙酸香茅酯（1.38%）、γ-欖香烯（3.72%）、正二十四烷（7.58%）、正三十烷（8.24%）等。對比發(fā)現(xiàn)，與不經(jīng)任何處理的傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾相比，經(jīng)過PEF協(xié)同酶法處理后，鑒定出的精油成分種類顯著增多，檢測出了更多的小分子化合物，二者共有24 種相同成分，其中重要香氣成分種類差別不大，但含量有所不同，表明PEF協(xié)同酶法處理使得精油香氣成分更多的釋放，對成分種類及含量有一定影響，但對主體香氣成分種類影響相對較小，保留了玫瑰精油的芳香特性。從成分角度看，PEF協(xié)同酶法輔助提取的長白山產(chǎn)玫瑰精油具有很高的利用價(jià)值。

3 結(jié) 論

酶法輔助提取玫瑰精油最佳工藝條件：蒸餾時(shí)間3.0 h，酶解溫度45 ℃，酶解時(shí)間120 min，酶解pH 4，加酶 量0.06%；PEF協(xié)同酶法輔助提取最佳條件：酶解時(shí)間90 min，蒸餾時(shí)間1.5 h，脈沖數(shù)10 個(gè)，電場強(qiáng)度20 kV/cm。

PEF協(xié)同酶法輔助提取玫瑰精油最佳工藝參數(shù)：蒸餾時(shí)間1.7 h，脈沖數(shù)10 個(gè)，電場強(qiáng)度21 kV/cm；對比實(shí)驗(yàn)表明，PEF協(xié)同酶法輔助提取精油得率比水蒸氣蒸餾和酶法輔助提取分別提高了約43.83%和20.48%，總耗時(shí)分別節(jié)省25%和40%，是一種高效的玫瑰精油提取方法。

GC-MS分析PEF協(xié)同酶法輔助提取玫瑰精油鑒定出63 種成分，占精油總量的95.04%，玫瑰精油的主要香氣成分均被檢測出。與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾提取相比，PEF協(xié)同酶法處理能夠促進(jìn)精油成分釋放并保留其芳香特性。