超聲-閃式聯合法制備藍莓花色苷提取物及其 體內外抗腫瘤活性評價

薛宏坤，譚佳琪，劉成海，劉 釵,

（1.東北農業大學工程學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農業大學農學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

藍莓中富含花色苷、多酚和黃酮等活性成分，具有較高的醫學和藥用價值，市場認知度高、需求量大，已被廣泛用于食品、藥品和保健品領域中[1]。其中花色苷屬于一種水溶性的天然色素，安全無毒。研究表明花色苷具有抗氧化、抗疲勞、抗炎、抗腫瘤和增強視力等 功效[2]。因此，如何高效地從藍莓中提取花色苷已成為當前研究的熱點。

目前，對花色苷的提取主要采用傳統的溶劑提取，該方法操作簡單，但耗時長，溶劑消耗量大，提取效率低，無法滿足當前需求[3]。隨著提取技術的發展，各種先進的提取技術應運而生，如微波提取[4]、超聲提取[5]、超臨界提取[6]和酶法提取[7]等技術已經用于花色苷的提取中，其中微波提取具有加熱速度快，效率高等特點，但由于萃取液內物料的極性不同，吸收和轉化微波能的能力不同，造成萃取液溫度分布不均，局部高溫造成熱敏性成分的降解，使之失去原有的生理活性[8]。超臨界提取對提取設備要求較高，價格昂貴。酶法提取條件溫和，但對pH值變化較敏感。超聲提取是利用其空化效應、熱效應和機械效應加速植物細胞壁破裂，降低細胞內活性成分傳質阻力，提高傳質系數，使細胞內的活性成分更容易從細胞中擴散到周圍溶劑中，從而提高效率[9]。另一種閃式提取法也是活性成分提取最常用的方法之一，其主要原理是通過高速旋轉的刀頭將植物組織細化成顆粒，并通過剪切效應、負壓滲濾和溶劑萃取等效應將植物細胞中的活性成分快速溶出，從而提高效率[10]。這兩種方法均具有提取效率高、操作簡單和過程易控制等特點，因而被廣泛應用于活性成分的提取中。目前，對于兩者聯合使用提取藍莓花色苷的研究還鮮見報道。關于提取后所得的花色苷的研究主要集中在對其進行分離純化、抗氧化活性等方面。而花色苷在抗腫瘤活性方面的作用也逐漸成為當前關注的熱點，但對其抗腫瘤作用機制尚無定論。

鑒于此，本研究采用超聲-閃式聯合提取法提取藍莓花色苷，通過單因素試驗探究超聲功率、閃提轉速、提取時間、料液比和乙醇體積分數對藍莓花色苷含量的影響，并分析不同萃取條件下花色苷的萃取特性；在此基礎上，通過遺傳算法優化花色苷提取工藝參數；采用體內和體外實驗探究花色苷提取物的抗腫瘤活性，并對其抗腫瘤作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BABL/c小鼠40 只，雌雄各半，6 周齡，體質量182 g，SPF級，由哈爾濱腫瘤醫院提供，許可證號為SCXK（黑）2006008。S180小鼠腹水瘤細胞由哈爾濱腫瘤醫院提供，由昆明種小鼠腹腔積液傳代。

半高叢藍莓 黑龍江省哈爾濱市東北農業大學園藝學院；無水甲醇、無水乙醇（均為分析純） 天津 市富宇精細化工有限公司；MTT、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS） 北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 上海萊昂生物科技有限公司；注射用環磷酰胺 江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；RPMI 1640和胎牛血清 美國Gibco公司；胰蛋白酶 國藥集團化學試劑有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡與壞死檢測試劑盒 碧云 天生物技術研究所；小鼠IL-12、IL-10、TNF-α酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海酶聯生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DK-98-IIA型恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；LAMBDA35型紫外-可見分光光度計 美國Perkin Elmer公司；TD-50凍干機 上海浦東冷凍干燥設備有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；LN12-JHBE50T閃式提取器 北京中西遠大科技有限公司；DS-3510DTH超聲波清洗器 上海奧析科學儀器有限公司；超聲-閃式聯合提取裝置為超聲波清洗器與閃式提取器組合改裝而成；MultiskanMk3型酶標儀、ST16R冷凍離心機 美國Thermo公司；細胞培養箱 美國Forma公司；TS100倒置熒光顯微鏡 日本Nikon 公司；Attune NxT流式細胞儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；BSC-20超凈工作臺 沈陽寶創實驗室設備有限公司；J-SG微量移液器 北京川布蘭科技發展有限公司；HZQ-F全溫振蕩培養箱 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；PRACTUM224-1CN分析天平 德國賽多利斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

實驗前將冷凍的藍莓從冰箱中取出，室溫解凍3 h，打漿，將果漿置于玻璃皿中，放在-18 ℃冰箱中冷凍12 h，然后置于真空冷凍干燥機凍至24 h，取出用植物粉粹機將其粉碎，過40 目篩，制成果粉，避光密封在4 ℃冰箱中保存備用。

1.3.2 藍莓花色苷提取物（blueberry anthocyanins extracts，BAE）的制備

取5 g藍莓果粉于提取容器中，按照1∶30（g/mL）的料液比加入體積分數60%乙醇溶液將其充分溶解，然后將提取容器置于超聲-閃式聯合提取裝置中，設定閃提轉速8 000 r/min，超聲功率350 W，提取時間10 min，提取結束后，將提取液置于離心機中以6 000 r/min離心15 min，將上清液收集于玻璃瓶中。向濾渣中再加入體積分數60%乙醇溶液，操作同上，提取2 次，合并3 次提取液。將其用旋轉蒸發儀于40 ℃減壓蒸發濃縮至浸膏質量不再發生變化，所得浸膏即為BAE，最后將其置于離心管中，放入4 ℃冰箱備用。

1.3.3 花色苷含量的測定

采用pH示差法測定不同提取條件下提取物中花色苷含量，參考于澤源等[11]的方法并略做改動。取1 mL樣品（BAE），分別加入9 mL pH 1.0氯化鉀緩沖液和9 mL pH 4.5乙酸鈉緩沖液，將其充分混合，避光靜止1 h，分別在520 nm和700 nm波長處測定其吸光度，分別依據式（1）和式（2）計算提取物中花色苷含量和純度。

式中：c為提取物中花色苷含量/（mg/g）；A為樣品提取液的吸光度；DF為稀釋倍數；mw為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質量（449.2）；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數（26 900）；m為藍莓果粉的質量/g；V為萃取液體積/mL；P為藍莓花色苷純度/%。

1.3.4 單因素試驗

在預實驗的基礎上，選擇乙醇為提取溶劑，超聲-閃式聯合法為提取藍莓花色苷的方法，操作同1.3.2節。以5 g藍莓粉為提取對象，對超聲功率、閃提轉速、提取時間、料液比和乙醇體積分數5 個因素進行單因素試驗，討論各因素對花色苷含量的影響。其中超聲功率設300、350、400*、450、500 W 5 個水平；閃提轉速設6 000、7 000、8 000*、9 000、10 000 r/min 5 個水平；提取時間設6、8、10*、12、14 min 5 個水平；料液比設1∶10、1∶20、1∶30*、1∶40、1∶50（g/mL）5 個水平；乙醇體積分數設40%、50%、60%*、70%、80% 5 個水平。結果均為3 次重復實驗所得的平均值。*表示當考察其他因素對藍莓花色苷含量影響時，用*標記的因素保持恒定水平。

1.3.5 響應面試驗

在單因素試驗結果的基礎上，以超聲功率（X1）、閃提轉速（X2）、乙醇體積分數（X3）為自變量，以花色苷含量（Y）為響應值。根據Box-Behnken試驗設計，因素與水平設計如表1所示。

表 1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Coded and actual levels of factors

采用響應面分析法得到的二次回歸模型如式（3）所示：

式中：b0為截距回歸系數；bi為線性回歸系數；bii為二次項的回歸系數；bij為交互項的回歸系數；Xi、Xj為自變量。

1.3.6 超聲提取、閃式提取和傳統溶劑提取法提取藍莓花色苷

超聲提取法條件設定為：超聲功率400 W、乙醇體積分數60%、料液比1∶30（g/mL）、提取時間10 min；閃式提取法條件設定為：轉速8 000 r/min、乙醇體積分數60%、料液比1∶30（g/mL）、提取時間10 min；傳統溶劑提取條件設定為：乙醇體積分數60%、料液比 1∶30（g/mL）、提取時間50 min，將上述3 種提取方式得到的花色苷含量與超聲-閃式聯合法（超聲功率400 W、轉速8 000 r/min、乙醇體積分數60%、料液比 1∶30（g/mL）、提取時間10 min）進行對比，根據藍莓花色苷含量判定提取方式的優劣。

1.3.7 遺傳算法設計

在單因素結果基礎上，選取超聲功率、閃提轉速和乙醇體積分數3 個因素為決策變量。即：

優化的約束條件：依據單因素試驗結果，選擇各因素水平的上下限，花色苷含量優化約束條件如下式所示：

1.3.8 BAE抗腫瘤活性體外實驗

1.3.8.1 MTT法檢測S180細胞的增殖

在上述最優參數組合下得到的BAE，參照劉燕琳等[12]的方法溶解于RPMI 1640培養基中，將BAE配制成質量濃度為（200、400、600、800、1 000 μg/mL）樣品溶液，溶液過0.22 μm濾膜，經除菌置于-20 ℃冰箱中保存。

S180細胞培養于含有質量分數10.0%胎牛血清、質量分數1.0%青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養基中，然后置于含體積分數5% CO2和90%相對濕度的培養箱中37 ℃恒溫培養。將處于對數期的S180細胞按1×105個/mL的密度分別接種于96 孔培養板，貼壁培養24 h。棄去上清液，用PBS清洗3 次，分別準確移取100 μL不同質量濃度的樣品加入到每孔中，陰性對照組用等量的完全培養基取代，48 h后，棄上清液，加入100 μL 1.0 g/L MTT孵育4 h，吸出MTT，加入DMSO，搖床低速振5 min，490 nm波長處測定吸光度。依據式（8）計算BAE對S180細胞的生長抑制率：

式中：A0為陰性對照組的吸光度；A1為給藥組的吸光度。

1.3.8.2 流式細胞儀檢測S180細胞的凋亡率及周期分布

S180細胞經過BAE樣品（質量濃度0（空白組）、200、400、600、800、1 000 μg/mL），處理48 h后，使用Annexin V-FITC/PI雙染色細胞凋亡檢測試劑盒檢測S180細胞的凋亡及周期分布。檢測方法嚴格按照試劑盒說明進行，在倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.3.9 BAE抗腫瘤活性體內實驗

1.3.9.1 實驗動物分組

采用隨機數字法，將40 只BABL/c小鼠分為5 組，每組8 只，雌雄各半，其分組為空白對照組、模型對照組、BAE低劑量組、中劑量組和高劑量組。

1.3.9.2 造模方法

將S180瘤株接種在昆明種小鼠的腹腔中，接種7 d后，選擇腹腔積液飽滿的荷瘤小鼠頸椎法將其處死，抽取乳白色的腹腔積液，然后將其稀釋成單細胞懸液，檢測活細胞數，成活率大于95%方可接種。調整細胞濃度為1×107個/mL，在模型對照組、BAE低劑量組、中劑量組和高劑量組每只BABL/c小鼠右側腋窩皮下接種0.2 mL，空白對照不接種，建立S180荷肉瘤小鼠模型。

1.3.9.3 給藥方式

實驗接種第2天開始，每天上午腹腔注射給藥，其中BAE低、中、高劑量組分別給予BAE100、200、 400 mg/（kg·d），空白對照組和模型對照組給予同體積的生理鹽水，給藥12 d，末次給藥24 h后，摘除眼球取血，離心取上清液。脫頸椎處死小鼠，剝離腫瘤，稱質量，依據式（9）計算抑瘤率：

按照馬新博等[13]操作方法，采用ELISA法檢測S180荷瘤小鼠血清中IL-12、IL-10和TNF-α的含量。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 對比不同提取方式對藍莓花色苷含量和純度的影響

圖 1 提取方式對藍莓花色苷含量和純度的影響Fig. 1 Effects of extraction methods on the yield and purity of anthocyanins

由圖1可知，4 種提取方式（超聲-閃式聯合法提取、超聲提取、閃式提取和傳統溶劑提取法）對藍莓花色苷純度無顯著影響（P＞0.05）。4 種提取方式下藍莓花色苷含量分別為（2.28±0.03）、（1.75±0.05）、（1.62±0.04）、（1.03±0.05）mg/g，超聲-閃式聯合法所得藍莓花色苷含量較超聲提取、閃式提取和傳統溶劑提取法分別提高了23.25%、28.95%和54.82%，研究結果表明超聲-閃式聯合法更適合提取藍莓花色苷，因此后續實驗均采用該方式對藍莓花色苷進行提取。

2.2 單因素試驗結果

圖 2 超聲功率（A）、閃提轉速（B）、提取時間（C）、料液比（D）和乙醇體積分數（E）對花色苷含量的影響Fig. 2 Effects of ultrasonic power (A), flash extraction speed (B), extraction time (C), solid-to-liquid ratio (D) and ethanol concentration (E) on the yield of anthocyanins

由圖2A可知，當超聲功率在300～400 W時，隨超聲功率增加花色苷含量顯著增加（P＜0.05）。其原因是隨超聲功率增加，超聲所產生的機械效應和空化效應能力增強[14]，造成藍莓細胞壁被破壞，使得花色苷由內向外的傳質阻力顯著降低[15]，因此花色苷更容易從藍莓細胞中擴散到溶劑中，進而提高花色苷含量[16]。但當超聲功率在400～500 W時，花色苷含量隨超聲功率增加呈現顯著降低的趨勢（P＜0.05）。這是由于超聲功率過高，產生的高強度空化作用破壞花色苷結構，使得花色苷含量顯著降低[17]。故選擇超聲功率在350、400、450 W 3 個水平進行組合實驗。

由圖2B可知，當閃提轉速在6 000～8 000 r/min時，隨閃提轉速增加花色苷含量顯著增加（P＜0.05），在8 000 r/min 時，花色苷含量達到最大值（1.95±0.06）mg/g。 其原因是隨閃提轉速增加，萃取液中所產生的剪切力顯著增加，較大的剪切力能有效破壞藍莓細胞壁[18]，從而使藍莓細胞中的花色苷更容易擴散到溶劑中，因此花色苷含量顯著增加。但當閃提轉速超過8 000 r/min 時，花色苷含量隨閃提轉速增加呈現顯著降低的趨勢 （P＜0.05）。該研究結果與朱興一等[19]采用閃提提取油茶枯餅中茶皂素結果一致。故選擇閃提轉速在7 000、8 000、9 000 r/min 3 個水平進行組合實驗。

由圖2C可知，提取時間在10 min前，花色苷含量隨提取時間延長呈現顯著增加的趨勢（P＜0.05），當提取時間超過10 min，花色苷含量隨提取時間無顯著變化 （P＞0.05）。通過方差分析可知，最佳提取時間為10 min，故后續實驗不再優化提取時間。高虹等[18]采用超聲-閃式聯合提取香菇柄麥角甾醇也有類似的結果。

由圖2D可知，當料液比在1∶10～1∶30（g/mL）時，花色苷含量隨溶劑用量增加而顯著增加（P＜0.05），在 1∶30（g/mL）時，花色苷含量達到最大值（2.13±0.06）mg/g。 其原因是隨萃取液用量的增加，固液濃度梯度增加，濃度梯度作為花色苷傳質驅動力，高濃度梯度有利于花色苷由內向外擴散，使得花色苷含量增加[20]。由于固液界面存在傳質極限，當萃取液用量繼續增加，固液界面的濃度差增幅逐漸降低[21]，故花色苷含量隨溶劑用量增加無顯著變化（P＞0.05）。通過方差分析知，最佳料液比為1∶30（g/mL），故后續實驗不再優化料液比。

由圖2E可知，當乙醇體積分數在40%～60%時，隨乙醇體積分數增加花色苷含量顯著增加（P＜0.05），其原因是隨乙醇體積分數增加，乙醇溶解能力增強，促進花色苷溶解，同時擴散系數增加，故花色苷含量增加[22]。在乙醇體積分數為60%時，其極性與花色苷極性相似，依據相似相容原理，此時花色苷溶解度最高，故花色苷含量取得最大值（2.28±0.03）mg/g。隨后隨乙醇體積分數增加花色苷含量顯著降低（P＜0.05），歸因于高體積分數乙醇使醇溶性的雜質、色素和親脂性強的成分溶出量增加，其成分與花色苷競爭乙醇-水分子[23-24]，使得花色苷溶出量降低，進而導致花色苷含量降低。故選擇乙醇體積分數在50%、60%、70% 3 個水平進行組合實驗。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 模型建立與顯著性檢驗

Box-Behnken響應面試驗方案和結果見表2。以花色苷含量（Y）為響應值，對實驗所得的數據進行多元回歸擬合分析，得到藍莓花色苷含量對超聲功率（X1）、閃提轉速（X2）和乙醇體積分數（X3）的數學模型如式（10）所示：

對式（10）系數進行顯著性檢驗，結果如表3所示。

表 2 Box-Behnken響應面試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

表 3 花色苷含量的回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic polynomial regression model

由表3可知，所得的數學模型決定系數R2=0.980 7，F=9.53，P＜0.000 1，表明所得模型極顯著。模型失擬項P=0.437 5＞0.05，表明模型失擬項不顯著，通過以上數據說明該模型對試驗數據擬合充分，可靠性較好，可以較好地描述各因素與響應值的真實關系。

圖 3 各因素交互作用的響應面和等高線圖Fig. 3 Response surface and contour plots showing the interactive effects of variables on the extraction yield of anthocyanins

依據F值大小可以判斷各試驗因素對花色苷含量影響的程度，F值越大，表明該試驗因素對提取效果的影響越顯著。由表3可知，F（X1）=93.63，F（X2）=6.96， F（X3）=113.92，即各試驗因素對藍莓花色苷含量的影響順序為乙醇體積分數＞超聲功率＞閃提轉速，且乙醇體積分數和超聲功率對花色苷含量的影響達到極顯著的水平。響應面的坡度陡峭程度可以反映該因素對藍莓花色苷含量影響的強弱，響應面相對平緩，說明該因素對花色苷含量影響作用較小。等高線圖的形狀說明試驗因素兩兩的交互作用是否顯著，如果等高線形狀是橢圓，則說明兩變量的交互作用顯著；若等高線形狀是圓，則說明變量的交互作用不顯著[25]。由圖3可知，藍莓花色苷含量均隨3 個試驗因素水平的增加呈現先增加后減小的趨勢，存在極大值。由等高線圖可以看出，3 個試驗因素兩兩的交互作用均呈現橢圓，表明因素之間的交互作用均顯著，這與方差分析的結果一致。等高線隨乙醇體積分數的變化趨勢高于超聲功率，而超聲功率的變化趨勢高于閃提轉速。綜上可知，對藍莓花色苷含量影響因素順序為乙醇體積分數＞超聲功率＞閃提轉速，該結果也與方差分析的結果一致。

2.3.2 超聲-閃式聯合提取藍莓花色苷的工藝參數優化

圖 4 遺傳算法優化結果Fig. 4 Results of optimization by genetic algorithm

遺傳算法相關參數設定如下：種群大小設定為180，變異率設定為0.2，交叉率設定為0.85，最大迭代設定為100，其余參數均使用系統默認值，經Matlab 2016軟件中的遺傳算法優化工具箱計算得出，迭代15 次，花色苷含量取得最大值，此時超聲功率（X1）、閃提轉速（X2）和乙醇體積分數（X3）水平編碼分別為1.00、0.44、0.81，即試驗水平分別為450.0 W、8 440.0 r/min、68.1%，在此條件下，所得花色苷含量理論值為2.85 mg/g。遺傳算法M文件運行結果如圖4所示。

2.3.3 驗證實驗

通過遺傳算法優化得到提取花色苷工藝參數組合為超聲功率450.0 W、閃提轉速8 440.0 r/min、乙醇體積分數68.1%，花色苷含量和純度的理論值分別為2.85 mg/g和31.15%。為驗證該方法的可靠性，考慮實際情況，將最佳工藝參數修正為超聲功率450 W、閃提轉速8 400 r/min、 乙醇體積分數6 8%，在此條件下所得花色苷含量和純度的驗證實驗值分別為（2.71±0.08）mg/g和（31.79±0.53）%，兩者理論值和實驗值的相對誤差分別為4.91%和2.05%。說明模型可以較好地模擬和預測藍莓花色苷含量和純度，進一步證明采用遺傳算法優化藍莓花色苷提取工藝參數可行。

2.4 不同質量濃度BAE對S180細胞體外增殖的抑制作用

圖 5 BAE對S180細胞生長抑制作用的劑量效應Fig. 5 Inhibitory effect of blueberry anthocyanin extract on growth of S180 cells

由圖5可知，不同質量濃度BAE處理S180細胞48 h后，S180細胞的抑制率隨BAE質量濃度增大呈現顯著增加的趨勢（P＜0.05）。當BAE質量濃度在200 μg/mL時，對S180細胞的抑制率為（18.12±0.86）%；而當BAE質量濃度在1 000 μg/mL時，對S180細胞的抑制率為（40.05±1.33）%，后者較前者對S180細胞的抑制率提高了21.93%。結果表明BAE能顯著抑制S180細胞增殖，并且BAE質量濃度越大，抑制效果越顯著，表現出顯著的劑量效應。

2.5 不同質量濃度BAE對S180細胞凋亡的影響

目前，大量研究證明BAE具有抗氧化和清除自由基的能力[26]，對癌細胞的增殖具有顯著的抑制作用，加速癌細胞的凋亡[27]。因此，本實驗在MTT的基礎上，進一步探究不同質量濃度BAE對癌細胞凋亡的影響。由圖6可知，不同濃度BAE（200、400、600、800、1 000 μg/mL）處理48 h后，S180細胞凋亡率分別為（18.82±0.93）%、（29.75±1.33）%、（42.55±2.01）%、（52.80±1.69）%和（66.25±1.54）%，與對照組相比，凋亡率分別提高了15.47%、26.40%、39.20%、49.45%和62.90%。結果表明，花色苷提取物能促進S180細胞凋亡，且質量濃度越大，S180細胞凋亡率越高。Urias-Lugo[28]和Yeh[29]等同樣研究發現花色苷提取物能顯著提高癌細胞的凋亡，其作用機制是通過上調和下調相關的凋亡蛋白和凋亡因子，從而促進癌細胞凋亡。

圖 6 不同質量濃度BAE作用48 h后S180細胞凋亡的影響Fig. 6 Apoptosis rate of cancer cells cultured for 48 h in the presence of blueberry anthocyanin extract at different concentrations

2.6 不同質量濃度BAE對S180細胞凋亡周期的影響

S180細胞經過BAE樣品（質量濃度0（空白組）、200、400、600、800、1 000 μg/mL），處理48 h后，S180細胞凋亡周期情況如圖7和表4所示。

圖 7 不同質量濃度花色苷提取物對S180細胞周期的影響Fig. 7 Effect of blueberry anthocyanin extract at different concentrations on cell cycle of S180 cells

表 4 BAE作用48 h對S180細胞周期的影響Table 4 Effect of blueberry anthocyanin extract on cell cycle of S180 cells at 48 h of culture

由圖7和表4可知，不同質量濃度BAE（200、400、600、800、1 000 μg/mL）作用于S180細胞48 h，與空白對照相比，S期細胞比例分別增加了9.59%、27.71%、36.57%、53.44%和63.87%，而G0/G1期細胞比例分別降低了11.01%、27.44%、41.33%和41.36%（除BAE質量濃度在200 μg/mL）。與空白對照相比，G0/G1期、S期細胞比例差異均有統計學意義（P＜0.05）。結果表明花色苷提取物使S180細胞主要阻滯于S期。

2.7 各組S180荷瘤小鼠的抑制效果

表 5 BAE對S180荷瘤小鼠瘤質量的影響Table 5 Effect of blueberry anthocyanin extract on tumor mass of sarcoma 180 tumor-bearing mice

由表5可知，與模型對照組相比，BAE低劑量組、中劑量組和高劑量組S180荷瘤小鼠瘤質量分別降低0.34、0.43、0.60 g，差異具有統計學意義（P＜0.05）。表明BAE對S180荷瘤小鼠的腫瘤有抑制作用。BAE低劑量組、中劑量組和高劑量組對S180荷瘤小鼠的抑瘤率分別為26.36%、33.33%和46.51%，高劑量組對S180荷瘤小鼠的抑瘤率較中劑量組和低劑量組分別提高了13.18%和20.15%，分析數據可知BAE質量濃度越大，對S180荷瘤小鼠的抑瘤率越高，說明BAE對S180荷瘤小鼠腫瘤生長有劑量效應。

2.8 各組S180荷瘤小鼠血清中IL-12、IL-10和TNF-α的含量

CD+T細胞分為Th0、Th1和Th2三個亞群。Th1具有提高NK、LAK細胞的毒性，誘導IL-2和g干擾素的產生，促進T細胞生成，介導細胞免疫應答。Th2具有分泌IL-4、IL-6、IL-10等細胞因子，促進B細胞增殖，介導體液免疫應答。在外界刺激下，Th0可轉化成Th1和Th2，Th1/Th2比值漂移與腫瘤形成相關，在惡性腫瘤中Th2占優勢[30-31]。Th1介導的細胞免疫承擔機體抗腫瘤免疫。IL-12促進Th0向Th1轉化，是Th1細胞免疫的啟動者之一，在抗腫瘤免疫中發揮正向調節作用。Th2分泌合成IL-10，它是重要的負調控因子，能有效抑制IL-12的合成。因此本實驗選擇Th1型細胞因子IL-12和Th2型細胞因子IL-10作為檢測指標，其結果如表6所示。

表 6 各組S180荷瘤小鼠血清中IL-12、IL-10和TNF-α的含量比較Table 6 Comparison of serum levels of IL-12, IL-10 and TNF-α in S180 tumor-bearing mice in control and treatment groups

由表6可知，模型對照組小鼠血清中IL-12含量較空白對照組顯著降低（P＜0.05），IL-10含量顯著增加 （P＜0.05），結果表明荷瘤小鼠造模成功。BAE作用荷瘤小鼠后，與模型對照組對比，BAE低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠血清中IL-12含量均顯著升高 （P＜0.05），而IL-10含量顯著降低（P＜0.05），且高劑量組和中劑量組在IL-12和IL-10含量變化幅度顯著高于較低劑量組。分析上述數據可知，移植腫瘤后，小鼠的免疫功能受到抑制，打破了Th1/Th2的平衡，Th2占優勢，而BAE作用后，IL-12含量顯著增加，進一步促進Th1細胞發揮免疫調節作用，同時IL-10含量顯著降低，使得Th2優勢地位被打破，從而使免疫反應向Th1漂移。因此，體內的腫瘤生長被抑制。實驗結果表明BAE是通過增強機體免疫功能，調節Th1/Th2漂移而發揮對腫瘤作用的抑制，且BAE質量濃度越大，抑制作用越強。

TNF-α是由巨噬細胞和單核細胞產生，對腫瘤細胞有明顯的殺傷作用。由表6可知，模型對照組、BAE低劑量組和中劑量組小鼠血清中的TNF-α含量均顯著低于空白對照組（P＜0.05），而高劑量組顯著高于空白對照組（P＜0.05）。經BAE作用后，與模型對照組相比，BAE低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠血清中TNF-α含量均顯著升高（P＜0.05），且劑量越大，TNF-α含量越高。結果表明BAE具有促進S180荷瘤小鼠產生TNF-α，從而達到抑制腫瘤生長的作用。

3 結 論

本研究在單因素試驗的基礎上進行響應面試驗，利用遺傳算法優化得出超聲-閃式聯合提取藍莓花色苷的工藝參數組合：提取時間10 min、料液比1∶30（g/mL）、 超聲功率450 W、閃提轉速8 400 r/min和乙醇體積分數6 8%，在此條件下花色苷含量和純度分別為（2.71±0.08）mg/g和（31.79±0.53）%。通過方差分析可知，該數學模型極顯著，所得的方程擬合度較高，對花色苷含量的影響主次順序為乙醇體積分數＞超聲 功率＞閃提轉速。通過體外S180細胞實驗和體內的S180荷瘤小鼠抑瘤實驗進一步證實BAE具有抑制腫瘤生長的作用，其作用是通過誘導細胞凋亡和增強機體免疫抑制腫瘤生長。本研究結果為藍莓花色苷提取和抗腫瘤藥物開發提供新思路。