不同腐乳醬營養、功能及呈味氨基酸量化表征

張建萍，解春芝,

（1.徐州工程學院食品與生物工程學院，江蘇 徐州 221018；2.江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，江蘇 徐州 221018）

腐乳與豆豉、醬油、豆醬并稱為我國四大傳統發酵調味品，是經磨漿、點漿、前酵、腌制、加輔料、后熟等工藝而成[1]。其風味獨特、營養均衡，富含優質蛋白和不飽和脂肪酸（亞油酸、油酸等）[2-3]，8 種人體必需氨基酸齊全，且氨基酸模式可與牛奶、雞蛋相媲美[4]。經微生物發酵后，腐乳消化率和生物效價也大幅提高，脹氣因子、豆腥味及苦澀味均被消除[5]。此外，豐富的活性成分賦予其良好的保健功效，如降膽固醇[6]、降血壓[7-8]、抗氧化[9]、降血糖活性[10]等。

傳統腐乳在發酵過程中，“禿斑”、“紅變”、“黃身”、“霉變”、“酸化”、“產氣”等現象時有發生。腐乳多為塊狀，生產中只能沿用手工操作進行擺籠、搓毛、腌制、裝瓶等，無法機械化生產，難以提高生產效率，嚴重制約規模化生產[11]。并且，塊狀的腐乳必須加封面汁液，否則，露空的腐乳會褐變發黑，甚至發臭，影響食用，限制了傳統腐乳市場的發展。針對這些問題，研發方便、質量均一且涂抹性和延展性良好的膏狀腐乳醬，得到了商家及學者關注。目前市售腐乳醬均以腐乳為主料，添加水、食鹽、香辛料、甜味劑等調配而成，工藝繁雜，種類較少，并且鮮見腐乳醬的相關報道[12-13]，限制了人們對不同腐乳醬的整體認知。

因此，本實驗采集5 種市售腐乳醬，對比其常規營養和功能成分，并采用主成分分析（principal component analysis，PCA）法綜合評價其呈味氨基酸，以期為腐乳醬的研發、生產工藝改善及消費者選購提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集的5 種腐乳醬樣品，分別來自北京市（BJ-1和 BJ-2）上海市（SH）、廣東省（GD）和河北省（HB）。

葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、齊墩果酸（均為色譜純） 中國國家標準物質信息中心；γ-氨基丁酸、β-谷甾醇、豆甾醇、氨基酸標準溶液 美國Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇、乙酸、三氟乙酸（均為色譜純）；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

P1201高效液相色譜儀 大連依利特分析儀器有限公司；ALPHA 1-2LD PLUS冷凍干燥機 德國Christ公司；R206B凱氏定氮儀 上海申生科技有限公司； TGL-16臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；SZF-06A脂肪測定儀 上海精密儀器儀表有限公司；KQ2200DV超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；L5S紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；Cascada LS超純水機 美國PALL公司；L8900氨基酸自動分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 常規營養理化指標測定

水分含量測定：參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》直接干燥法；蛋白質含量測定：參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》凱氏定氮法；脂肪含量測定：參照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》索氏抽提法；淀粉含量測定：參照GB 5009.9—2016《食品中淀粉的測定》酶水解法；食鹽含量測定：參照GB 5009.42—2016《食鹽指標的測定》直接滴定法；氨基酸態氮和總酸含量測定：參照SB/T 10170—2007《腐乳》電位滴定法。其中，脂肪、蛋白質、淀粉、食鹽、總酸、氨基酸態氮均以干基計。

1.3.2 功能成分測定

樣品制備：腐乳醬冷凍干燥后，研磨過100 目篩。稱取3.0 g樣品，加入40 mL體積分數80%乙醇溶液中，超聲處理30 min，溫度40 ℃，功率600 W，離心20 min（7 000 r/min），過濾后，定容至50 mL，過膜（0.22 μm），得供試液。

黃酮類化合物測定：參照李昕等[14]高效液相色譜法，并略有調整。ZORABX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min，檢測波長254 nm，進樣量20 μL，以乙腈（A）和0.1%乙酸溶液（B）為流動相，梯度洗脫條件為：0～15 min，70%～50% B；1 5 ～2 5 m i n，5 0%～4 0% B；2 5 ～3 0 m i n，40%～30% B；30～40 min，30%～70% B。

植物甾醇和γ-氨基丁酸的測定：采用高效液相色譜方法，所用色譜儀、色譜柱、柱溫及進樣量均與異黃酮測定相同。其中，植物甾醇流動相為0.1%乙酸-甲醇溶液，流速0.8 mL/min，波長210 nm，總運行時間20 min。γ-氨基丁酸以甲醇（A）和去離子水（B）為流動相，檢測波長254 nm，流速1.0 mL/min。梯度洗脫條件：0～15 min，70%～50% B；15～25 min，50%～40% B；2 5 ～3 0 m i n，4 0%～3 0% B；3 0 ～4 0 m i n，30%～70% B。

大豆皂苷含量測定采用香草醛-高氯酸法[15-16]。配制不同質量濃度齊墩果酸標準溶液，于60 ℃水浴蒸干后，加入0.2 mL 5%的香草醛-冰醋酸溶液以及0.8 mL高氯酸，搖勻；于65 ℃加熱15 min，取出后冰水中冷卻5 min，加入5 mL冰醋酸，充分混勻后靜置15 min。在560 nm波長處測定吸光度，并繪制標準曲線。取200 μL樣品溶液，依次加入200 μL 5%的香草醛-冰醋酸溶液以及0.8 mL高氯酸，其余處理步驟同標準溶液，通過標準曲線計算出腐乳醬中皂苷含量。各功能性成分均以干基計。

1.3.3 呈味氨基酸含量測定

參考Xie Chunzhi等[17]的方法，根據Tseng等[18]描述的游離氨基酸滋味特征，分為鮮味（天冬氨酸、谷氨酸）、甜味（丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸）、苦味（精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸）和無味（半胱氨酸、賴氨酸、脯氨酸）4 類。

1.4 數據處理

采用SPSS 17.0軟件進行數據處理和PCA。在方差分析結果顯著時，采用Duncan法進行多重比較，并用不同小寫字母表示組間差異顯著（P＜0.05），相同小寫字母表示組間差異不顯著（P＞0.05）。

2 結果與分析

2.1 常規營養指標分析

表 1 腐乳醬常規營養指標分析Table 1 Nutritional composition of different sufu paste samples

如表1 所示， 腐乳醬水分質量分數較高（52.21%～67.71%），且差異顯著（P＜0.05）。可能是陰離子及其離子強度對蛋白凝膠持水力的影響，導致腐乳醬顆粒內凝膠網絡的差異[19]。蛋白質（6.78%～10.85%）、脂肪（4.71%～8.59%）和淀粉（5.30%～26.78%）是腐乳醬的主要營養成分，也是腐乳醬獨特風味和質構的物質基礎，其含量的差異主要取決于腐乳醬調配輔料、原料大豆以及發酵程度等。例如，BJ-1調配輔料中不含小麥粉，其淀粉含量（5.30%）遠低于其他種類腐乳醬。腐乳醬中食鹽含量（8.47%～10.90%）低于腐乳（30.08～45.85 g/100 g）[17]， 這可能源于腐乳醬調配過程中大量水和輔料的添加降低了食鹽的濃度。除了賦予腐乳醬咸味，食鹽也可通過影響微生物酶活性，控制腐乳發酵過程中微生物代謝和抑制有害菌生長[20]。作為衡量腐乳質量和發酵成熟度的重要參數[21]，腐乳醬中氨基酸態氮和總酸差異顯著（P＜0.05），質量分數分別為0.31%～0.82%和0.34%～1.16%。微生物發酵過程中蛋白質分解成小分子的肽和氨基酸，是氨基酸態氮的重要來源[22-23]，而總酸則取決于微生物細胞自溶產生的具有羧基側鏈的游離氨基酸、脂肪酸、小分子肽、有機酸等[24]。

2.2 功能成分比較

圖 1 腐乳醬功能成分含量分布Fig. 1 Contents of functional components in different sufu paste samples

如圖1 所示，不同腐乳醬功能成分含量差異顯著（P＜0.05）。黃酮類化合物對多種疾病具有預防和治療功效，如消炎、抗老化、抗腫瘤、抑制骨質疏松癥、減緩動脈硬化等[25-26]。由圖1A、B可知，葛根素含量最高（4.80～12.18 mg/100 g），其中BJ-1高達12.18 mg/100 g，約為HB的2.5 倍。其次分別為染料木素（0.21～0.32 mg/100 g）、大豆苷元（0.1 2 ～0.2 7 m g/1 0 0 g）和大豆苷（0.09～0.13 mg/100 g）。但其含量遠低于腐乳，比如含鹽量為15%腐乳中的大豆苷元和染料木素在后酵第25天可達到最大值12.00 mg/100 g和19.67 mg/100 g，而大豆苷的含量則逐漸下降，直至無法檢出，說明糖苷被分解成相應的苷元[27]，馬艷莉[28]和Yin Lijun[29]等也得出類似結論。研究表明，影響大豆制品中黃酮類化合物含量的因素很多，包括品種、貯藏條件、子粒部位、加工方法等[25]。就腐乳醬而言，豆腐制作過程中復雜的工序包括浸泡、蒸煮、磨漿、過濾、成型等，可導致異黃酮流失；另一方面，毛坯制備和腐乳后酵過程中，產生大量 β-葡萄糖苷酶，使異黃酮糖苷被分解成相應的苷元和其他化學成分。γ-氨基丁酸含量豐富（6.82～13.67 mg/100 g），B J - 1 中 達1 3 . 6 7 m g / 1 0 0 g （ 圖1 C ） 。 腐乳后熟過程中，微生物生長代謝可有效促進γ-氨基丁酸的累積，如短乳桿菌和地衣芽孢桿菌[30-31]。作為豆科植物的主要藥效成分之一，大豆皂苷多用于保健品、食品添加劑及化妝品中，具有降血脂以及抗衰老的作用[32]。 腐乳醬中大豆皂苷含量介于1.28 mg/100 g（BJ-2）和3.20 mg/100 g（HB）之間。與其他腐乳醬相比，BJ-1中豆甾醇和β-谷甾醇均最高，分別為0.07 mg/100 g和0.13 mg/100 g。其中，BJ-1中β-谷甾醇含量為BJ-2的4 倍左右（圖1D）。綜上所述，不同腐乳醬功能成分含量豐富，BJ-1最高，GD和HB次之。

2.3 呈味氨基酸譜分析

2.3.1 呈味氨基酸組成和含量分析

表 2 腐乳醬游離氨基酸含量Table 2 Free amino acid profiles of different sufu paste samples

游離氨基酸可作為風味形成的前體物質，對發酵食品尤其是以蛋白為主要發酵基質的大豆發酵食品獨特滋味和香氣的形成具有重要貢獻[33]。如表2所示，腐乳醬中共檢測到15 種游離氨基酸，且差異顯著 （P＜0.05）。谷氨酸最豐富，含量為0.90～3.71 mg/g， 亮氨酸次之（0.37～0.60 mg/g）。總游離氨基酸（total free amino acid，TFAA）含量最高的為HB，為7.48 mg/g，其次為BJ-2（5.54 mg/g），SH（4.99 mg/g）和GD（4.81 mg/g）含量相當。必需氨基酸（essential amino acid，EAA）和抗氧化氨基酸（antioxidative amino acid，AFAA）含量最高的均為HB，分別為2.13 mg/g和0.84 mg/g，而EAA/TFAA和AFAA/TFAA最高的則均為BJ-1，其占比分別為0.46和0.18。游離氨基酸的組成和含量除與原料豆有關外，還與發酵過程中微生物群落結構密切相關，如張慧林等[34]發現Weissella、Millerozyma和Aspergillus對傳統發酵豆醬游離氨基酸含量具有重要影響。

圖 2 腐乳醬游離氨基酸滋味特征Fig. 2 Taste characteristics of free amino acids in different sufu paste samples

營養、安全和感官是評價食品的三大要素，而感官質量最重的屬性之一是滋味[35]。因此，根據滋味特征，游離氨基酸被分為鮮味、甜味、苦味和無味4 類。由 圖2可知，HB、BJ-2和SH中鮮味氨基酸為主，其含量分別為3.71、2.82 mg/g和2.64 mg/g，而BJ-1（1.89 mg/g）和GD（1.92 mg/g）中苦味氨基酸略占優勢。與腐乳的滋味特征譜一致，即咸味為主，并呈強烈鮮味，略帶苦 澀味[17]。鮮味氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸，可作為食品風味增強劑，除源于發酵體系中蛋白質分解代謝，還與腐乳醬調配過程中外源輔料谷氨酸鈉的添加密切相關，而苦味氨基酸則可能源于不協調的蛋白水解。甜味和無味氨基酸所占比例較小，且含量相當。各呈味氨基酸相互協作，共同作用，賦予腐乳醬獨特滋味特征。

2.3.2 呈味氨基酸PCA

表 3 主成分的特征值和貢獻率Table 3 Characteristic values and contributions of principal components

表 4 主成分的載荷矩陣Table 4 Loading matrix of principal components

PCA利用降維原理，既可簡化變量個數，又能獲取足量信息，避免了主觀隨意性[36]。如表3所示，前 4 個主成分的貢獻率分別為52.56%、23.91%、11.16%、5.08%，累計貢獻率為92.70%。說明提取4 個主成分較合適，基本包含了所有游離氨基酸的組成信息。綜合 表3、4可知，PC1主要反映谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸的變異信息，PC2主要反映亮氨酸、酪氨酸、組氨酸的變異信息，PC3主要反映苯丙氨酸、精氨酸的變異信息，PC4主要反映脯氨酸的變異信息。

由于PCA中前4 個主成分反映了15 個指標變量信息的92.70%，說明利用F1、F2、F3和F4綜合指標對腐乳醬呈味氨基酸進行評價是可行的，其對應的線性關系式分別為：

F1=0.020X1-0.005X2+0.118X3+0.106X4+0.023X5+0.123X6-0.061X7+0.122X8+0.126X9+0.116X10+0.118X11+ 0.002X12+0.116X13-0.075X14+0.067X15

F2=0.237X1-0.211X2-0.076X3+0.105X4+0.259X5+0.008X6+0.134X7-0.005X8-0.007X9-0.075X10+0.048X11+ 0.182X12+0.056X13-0.039X14-0.174X15

F3=0.248X1+0.347X2+0.051X3-0.039X4+0.184X5+ 0.114X6+0.430X7+0.148X8+0.011X9+0.026X10-0.118X11-0.347X12-0.121X13-0.078X14+0.049X15

F4=-0.027X1+0.197X2-0.056X3+0.388X4+0.031X5+ 0.140X6-0.015X7-0.044X8+0.082X9+0.268X10+0.052X11-0.111X12+0.017X13+0.92014-0.396X15

表 5 腐乳醬主成分綜合得分及排序Table 5 Principal component scores and ranking of different sufu paste samples

主成分越重要，方差貢獻率越大[37]，以每個主成分所對應的方差貢獻率為權重，構建綜合評價模型F=0.526F1+0.239F2+0.112F3+0.051F4，計算各樣品綜合得分。對不同腐乳醬綜合得分進行排序，即可對各個樣本的呈味氨基酸組成進行綜合評價，結果見表5。總綜合評分越高，表示該腐乳醬呈味氨基酸綜合品質越好。呈味氨基酸組成綜合評分排序為GD＞HB＞BJ-1＞BJ-2＞SH。說明不同腐乳醬呈味氨基酸綜合質量存在差異，GD的呈味氨基酸綜合質量最高，HB次之，SH最低。風味，作為食品的重要屬性之一，決定著消費者可接受度。食品風味物質包括呈香（香味）和呈味（滋味）兩部分，呈味主要源于游離氨基酸、游離脂肪酸、小分子肽等，而呈香物質主要為揮發性風味物質。本實驗僅就腐乳醬的呈味氨基酸進行綜合評價，為腐乳醬的研發、生產工藝改善及消費者選購提供了科學依據。后續研究應聚焦于其他風味成分，并結合感官分析，從而更為全面系統的評價腐乳醬的風味品質。

3 結 論

本實驗分析了腐乳醬主要營養、功能成分及呈味氨基酸。結果表明，腐乳醬營養、功能成分豐富，且差異顯著（P＜0.05）。共檢測到15 種游離氨基酸，谷氨酸最豐富，亮氨酸次之。根據呈味特征，HB、BJ-2和SH中鮮味氨基酸為主，而BJ-1和GD中苦味氨基酸略占優勢。PCA表明，前4 個主成分的累計貢獻率為92.70%，可較好反映呈味氨基酸組成的基本信息。不同腐乳醬呈味氨基酸綜合評分存在差異，GD最高，HB次之，SH最低。該研究結果可為腐乳醬的研發、生產工藝改善及消費者選購提供科學依據。腐乳醬食用方便，質量均一，且涂抹性和延展性良好。但目前腐乳生產大多沿用傳統工藝，后熟時間長（2～6 個月），季節限制嚴重，廠房占用面積大，降低了其生產效率。而市售腐乳醬均是以塊狀腐乳為原料進一步調配而成，工藝繁雜，生產周期更為漫長，導致其種類很少，嚴重制約了規模化生產和推廣。因此，未來腐乳醬研究應取長補短，著力于縮短后熟期，如毛坯微細化處理，菌劑強化發酵等，促進腐乳醬產業發展。