濃香型白酒發酵新老窖泥理化因子和 原核微生物群落結構差異分析

張會敏，王艷麗，孟雅靜，王銀輝，李安軍，王志強，張治洲，邢新會

（1.安徽省固態發酵工程技術研究中心，安徽 亳州 236820；2.清華大學化工學院，北京 100084；3.哈爾濱工業大學海洋科學與技術學院，山東 威海 264209）

中國濃香型白酒發酵是一個重要的微生物發酵研究領域，其在窖池中進行。窖池窖泥中豐富的菌群發酵形成豐富的代謝產物，對白酒中呈香味風味物質的形成具有重要作用[1]。釀酒界有句話“千年老窖，萬年糟，好酒全憑窖池老”，經驗性地說明了窖泥的窖齡與白酒發酵質量的相互關系。Wang Xueshan等[2]通過主坐標分析發現，酒醅原核菌群在發酵中期與大曲原核菌群的差異有增大趨勢，而在整個發酵過程中則與窖泥原核菌群維持恒定關系，說明窖泥與酒醅之間存在穩定的相互關系。Deng Bo等[3]通過變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）分析發現不同窖齡的窖泥菌群同時存在合作和抑制關系，這種共存的復雜關系導致窖泥菌群結構的進化演變。Tao Yong等[4]通過焦磷酸高通量測序研究了四川某濃香型白酒公司1、10、25 a和50 a窖齡窖泥中的原核微生物群落變化，發現隨著窖泥窖齡從1 a增加到25 a，窖泥菌群豐度逐漸增加，而25 a和50 a窖齡的窖泥菌群結構無顯著差異。Liu Maoke等[5]通過Illumina高通量測序進一步發現40 a窖齡與400 a窖齡的窖泥菌群結構差異不明顯。由此可知，在周期性的發酵模式影響下，窖泥菌群各種菌屬之間至少需要25 a復雜的合作與競爭作用時間，窖泥菌群結構才基本達到穩定狀態，也就是業內所說的老熟狀態。

在窖泥菌群老熟過程中，窖泥菌群與其所在的理化環境相互適應，相互影響，共同轉變。窖泥老熟需要一個穩定的過程，如果維護不當也會造成窖泥退化。在實際生產中，根據窖泥狀態可以將其分為不同等級，Hu Xiaolong等[6]將窖泥分為退化、正常和優質3 個等級。比較分析不同等級窖泥[6]與不同窖齡窖泥[4]的理化性質發現：退化窖泥[6]與新窖泥（10 a以下）[4]的pH值、乳酸含量等理化指標更相近；優質窖泥[6]與老窖泥[4]的理化指標更接近。因此，弄清楚窖泥的正常老熟過程對避免窖泥退化具有重要意義。Liang Huipeng等[7]對分別來自四川省和安徽省的窖泥菌群進行研究，發現兩者退化等級窖泥的菌群組成差異不大，而兩個地區的優質窖泥的菌群結構差異明顯。說明窖泥老熟過程受當地環境的影響，這可能也是目前來自不同產地的眾多濃香型白酒風味差異的原因。

本研究選取安徽省某著名濃香型白酒公司的新窖池（4 a窖齡）和老窖池（50 a以上窖齡）的窖泥作為研究對象，分析新老窖泥的理化性質差異、細菌菌群結構差異、內部菌屬之間的關系差異，并建立窖泥理化性質與細菌菌群結構之間的典型相關分析（canonical correlation analysis，CCA），以期深入解讀新老窖泥菌群差異的原因，建立窖泥老熟理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

窖泥樣本 安徽某知名濃香型白酒企業；Omega土壤DNA提取試劑盒（D5625） 美國Omega BioTek公司； AP-GX-50凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司；其他試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

FE20 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；6890氣相色譜儀（配CP-WAX 57 CB色譜柱（50 m×0.25 mm，0.2 μm）） 美國Agilent公司；Acquity超高效液相色譜（配二極管陣列檢測器和HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）） 美國Waters 公司；ICS5000+離子色譜儀（配ICS-5000+-DC電導檢測器） 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥樣本采集

采用九點取樣法[8]取窖泥樣本12 個。6 個新窖泥樣本（窖齡4 a），標記為PM_N1～PM_N6；6 個老窖泥樣本（窖齡≥50 a），標記為PM_O1～PM_O6。置于無菌袋中，于-80 ℃貯存，待用。

1.3.2 理化性質分析

采用烘干法[5]檢測窖泥水分；使用pH計（FE20）檢測窖泥pH值（將新鮮窖泥與去離子水按照1∶3質量體積比混勻靜置后檢測[6]）；采用紫外分光光度計檢測銨態氮含量[9]；采用油浴法檢測腐殖質含量[9]；采用滴定法檢測總酯含量[10]。

將新鮮窖泥與15%甲醇溶液按照1∶9（g/mL）混勻，30 ℃超聲處理40 min后，0.22 μm濾膜過濾得到浸提液，用于檢測其中有機酸醇酯含量。使用氣相色譜檢測揮發性有機酸酯和乙醇含量：進樣量1 μL；柱流速 1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；分流進樣，分流比30∶1；柱溫箱程序升溫條件為：初始溫度35 ℃，以2 ℃/min升溫速率升溫至60 ℃，保持4 min，再以6 ℃/min速率升溫至195 ℃，保持20 min；氫火焰離子檢測器溫度250 ℃。采用液相色譜方法檢測非揮發性乳酸含量：進樣量1 μL；流動相為0.02 mol/L的KH2PO4溶液；柱流速 0.1 mL/min；檢測波長208 nm；柱溫30 ℃。

將新鮮窖泥與去離子水按照1∶1 0（g/m L）混勻，8 000 r/min離心5 min，取上清液過濾，用離子色譜儀檢測其可溶性K+與Ca2+濃度。離子色譜柱為IonPacTMCS12A RFICTM（4 mm×250 mm）；進樣量25 μL；柱流速1 mL/min；柱溫30 ℃；流動相為20 mmol/L 甲基磺酸溶液，等濃度洗脫；檢測器為ICS-5000+-DC電導檢測器。

1.3.3 DNA提取與Illumina高通量測序

使用Omega土壤DNA提取試劑盒（D5625）提取窖泥DNA。然后，通過上海派森諾生物科技股份有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。引物為：520F（5’-7 bp barcode+GCA CCT AAY TGG GYD TAA AGNG-3’）和802R（5’-TAC NVG GGT ATC TAA TCC-3’），擴增16S V4區。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）25 μL擴增體系：0.25 μL Q5高保真DNA聚合酶，5 μL 5×PCR Buffer，5 μL 5×High GC Buffer，2 μL dNTP（2.5 mmol/L），2 μL DNA模板，1 μL上下游引物（10 μmol/L），8.75 μL雙蒸水。PCR擴增程序：98 ℃完全變性2 min；25 個循環擴增：98 ℃變性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s；72 ℃完全延伸5 min。PCR擴增產物純化（AP-GX-50凝膠回收試劑盒）后，熒光定量（QuantiT PicoGreen dsDNA Assay Kit），構建克隆文庫（TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit，Illumina）。經過Agilent 2100 Bioanlyzer確定DNA文庫合格后，進行Illumina MiSeq雙向測序（MiSeq Reagent Kit V3）。

1.3.4 測序數據處理與統計學分析

去掉長度小于150 bp或者大于300 bp、模糊堿基數大于1、同聚堿基數目大于8、引物錯配大于1 bp的序列（QIIME，v1.8.0）；雙向拼接（FLASH軟件[11]v1.2.7）序列、剔除嵌合體（USEARCH，v5.2.236）得到優質序列。UCLUST聚類（97%相似度）優質序列得到各可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），認定各OTU中豐度最高的序列為其代表序列。在80%可信度水平，使用Greengene數據庫（Release 13.8）注釋各代表序列的結果即為OTU的注釋結果。通過Mothur軟件（1.36.1）得到Shannon、Chao 1等指數?；贠TU列表的主成分分析、主要OTU之間的Pearson相關性分析和CCA均通過R語言（R3.3.2）實現。窖泥菌群組成的差異顯著性分析通過Metastats檢測實現[12]。窖泥樣本理化因子之間的差異顯著性分析通過SPSS（24.0）方差分析（ANOVA）實現。

2 結果與分析

2.1 窖泥樣本的理化性質

新老窖泥的水分、腐殖質、己酸、丁酸、乳酸乙酯和乙酸乙酯含量不具有顯著性差異；兩者pH值、銨態氮、乙醇、乙酸、丙酸、乳酸、己酸乙酯、K+、Ca2+和總酯含量具有顯著性差異（表1）。老窖泥的pH值、銨態氮、乙酸和K+含量顯著高于新窖泥；而新窖泥中乙醇、丙酸、乳酸、己酸乙酯、可溶性Ca2+和總酯含量則顯著高于老窖泥。新老窖泥之間的理化性質存在差異，說明新老窖泥菌群所處的生存環境存在差異，該差異體現了窖泥菌群通過其代謝作用隨著時間的推移對窖泥的作用效應。

表 1 新老窖池窖泥樣本的理化性質Table 1 Physicochemical properties of young and old PM samples

2.2 窖泥原核微生物群落的α多樣性

表 2 新老窖泥細菌群落豐度和多樣性參數Table 2 Bacterial community richness and diversity indices of young and old pit mud samples

通過Illumina MiSeq高通量測序，得到580 157 條平均長度為207 bp的優質序列，平均38 795～78 904 條/樣本。對所有樣本二次抽平為38 457 條，進行后續分析。OTU聚類（97%相似度）得到2 559 個OTU（≥3 條序列/OTU），OTU平均611～1 044 個/樣本。每個樣本的測序覆蓋率大于98%，說明測序數目足夠，測序序列可以代表其菌群組成。得到注釋（門、綱、目、科、屬）的序列大于99%，無法得到注釋的序列低于0.08%，說明對窖泥中大量的未培養菌也充分實現系統分類。老窖泥菌群的Shannon指數顯著大于新窖泥，說明老窖泥的菌群多樣性和豐度大于新窖泥，與Tao Yong[4]和Liu Maoke[5]等的研究結論一致。老窖泥菌群的Chao 1指數略低于新窖泥菌群的Chao 1指數，說明老窖泥的菌群物種數目略低于新窖泥，但不顯著（表2）。

2.3 窖泥原核微生物群落的β多樣性

對OTU注釋，總共得到43 個門，其中41 個細菌門，2 個古菌門。分析平均相對豐度，厚壁菌門（Firmicutes）在老窖泥（69.0%）和新窖泥（73.5%）中，均為絕對優勢菌門。與新窖泥相比，老窖泥中，擬桿菌門（Bacteroidetes，10.4% vs 3.7%）、互養菌門（Synergistetes，7.2% vs 0.27%）和廣古菌門（Euryarchaeota，6.1% vs 1.0%）具有顯著優勢；與老窖泥相比，新窖泥中變形菌門（Proteobacteria，15.2% vs 1.58%）和放線菌門（Actinobacteria，4.2% vs 0.59%）具有顯著優勢。以上6 個門在老窖泥或者新窖泥中相對豐度超過1%，為優勢門，其序列數占總測序數的96.3%，占每個樣本序列數的92.2%～99.1%。排名20 名以后的門，其總序列數小于總測序數的0.01%，為稀有菌門，如脫鐵桿菌門（Deferribacteres）。含量最多的前20 個門相對豐度如圖1所示。

圖 1 窖泥中豐度最高的20 個門的相對豐度Fig. 1 Relative abundances of the top 20 phyla in PM

對OTU注釋，共得到306 個屬，注釋度為76.87%，其余序列只能不同程度地注釋到門、綱、目、科等級別。相對豐度超過1%的優勢菌屬為乳酸菌屬（Lactobacillus）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、喜熱菌屬（Caloramator）、梭菌屬（Clostridium）、氨基酸菌（Aminobacterium）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、互營單胞菌屬（Syntrophomonas）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）和沉積菌屬（Sedimentibacter）（圖2）。

對12 個窖泥樣本的OTU列表進行主成分分析聚類（圖3），結果表明，新老窖泥樣本分別聚類，兩者在第1主成分（74.97%）的差異非常明顯，而在第2主成分（13.29%）的差異較小。兩組樣本組內聚類效果相比，老窖泥樣本的聚類更集中，說明老窖泥菌群之間一致性更好，即該研究中老窖泥菌群已經達到老熟狀態[4]。而新窖泥樣本聚類分散，說明各新窖泥菌群之間差異性比較大。老窖泥菌群一致性好于新窖泥菌群的一致性，與Liang Huipeng等[7]的結論一致。

圖 2 窖泥中豐度最高的20 個屬的相對豐度Fig. 2 Relative abundances of the top 20 genera in PM

圖 3 新老窖泥菌群OTU組成的主成分分析聚類圖Fig. 3 Cluster analysis of the OTU composition of old and young PMs based on principal component analysis

鑒于新老窖泥菌群聚類（圖3）分為兩組，分組分析相對豐度最多的20 個屬在新老窖泥中的菌種組成（圖4）。其20 個屬中，12 個屬的組成具有顯著差異。Ruminococcus和Lactobacillus在新老窖泥中相對豐度都很大，前者差異不顯著，后者差異顯著，其在新窖泥中的平均相對豐度（39.69%）遠高于老窖泥中的平均相對豐度（5.97%）。而相對豐度排名4～8的Clostridium、Aminobacterium、Syntrophomonas、Methanoculleus和Sedimentibacter在老窖泥中的平均相對豐度比新窖泥中的平均相對豐度高5.3%～10.3%，其在新老窖泥中的組成差異可能和兩者的代謝功能差異有密切關系。Clostridium，如現已知克氏梭菌[13]與濃香型白酒中典型風味物質己酸的產生有關。Aminobacterium參與降解氨基酸[14-15]，很可能與提供窖泥菌群豐富的銨態氮有關。Methanoculleus參與代謝短鏈脂肪酸，產生甲烷，參與提高濃香型白酒的釀酒質量[16]。Sedimentibacter可以降解氨基酸[17]，有可能與生成銨態氮有關。

圖 4 新老窖泥樣本相對豐度最高的20 個屬的相對豐度Fig. 4 Relative abundances of the top 20 genera in young and old PMs

2.4 新老窖泥中主要OTU之間的相關性分析

圖 5 新窖泥中數量最多的前50 個OTU之間的Pearson相互關系圖Fig. 5 Pearson’s r correlation among the top 50 OTUs in young PM samples

新窖泥中數量最多的50 個OTU（占82.35%）之間的Pearson關系如圖5所示。圖中顯示了OTU的排名與注釋信息，如圖5中第1個OTU，“BN24_denovo218_g_Methanocorpusoculum”即為新窖泥中數量排名第24的OTU，注釋信息為Methanocorpusoculum屬。圖中下劃線標注的為新老窖泥所共有的14 個OTU，占新窖泥的59.17%。根據各OTU之間的相關關系，分為I組（56.42%）與II組（25.93%），組內OTU呈強烈正相關，而組間呈負相關。I組可以分為兩個小組： I（A）與I（B）組，小組內部OTU呈正相關，而彼此之間呈現微弱的相關關系。I（B）組中，含有一些排名比較靠前的OTU，比如排名第1（BN1_denovo2919_g_Lactobacillus）與排名第2（BN2_denovo3167_g_Ruminococcus）的OTU，兩個OTU的序列總數高達44.51%。盡管I（A）組中與老窖泥共有的OTU數目比較多，不過序列比例很低（3.8%）。推測I組和II組的OTU在組內呈現協同關系，而兩組之間呈現競爭/拮抗關系。

圖 6 老窖泥中數量最多的前50 個OTU之間的Pearson相互關系圖Fig. 6 Pearson’s r correlation among the top 50 OTUs in old PM samples

老窖泥中數量最多的50 個OTU（72.63%）之間的Pearson關系如圖6所示。首先，老窖泥OTU之間的關系相對復雜。根據OTU之間的相互關系，可以將老窖泥OTU分為5 個小組（A、B、C、D、E），組內OTU呈正相關，而組間既有正相關又有負相關。其次，5 組OTU的分布比較均勻。老窖泥中新老窖泥所共有的OTU，其比例由59.17%變為40.27%，有所下降，其余OTU的增加說明老窖泥中菌種的變化。有些細菌盡管屬名沒有發生改變，其菌種及其功能已經發生了改變。新窖泥中排名第1的OTU（BN1_denovo2919_g_Lactobacillus）在老窖泥中排名第7，新窖泥排名第2的OTU（BN2_denovo3167_g_Ruminococcus）在老窖泥排名變為第1。兩者之間的關系也由新窖泥中的正相關變為老窖泥的負相關關系。老窖泥5 組窖泥菌群之間既有協同關系（相互依存）又有競爭關系。Deng Bo等[3]PCR-DGGE得出結論：窖泥菌群內部合作與限制關系共存促進了窖泥菌群的進化演變。比較圖5與圖6，老窖泥菌群內部既相互依存又相互競爭的關系更強，即隨著窖泥的老熟，窖泥菌群之間的關系更加復雜融合。

2.5 窖泥理化性質與菌群之間的CCA

圖 7 新老窖泥差異顯著的10 個理化因子與窖泥菌群之間的CCA關系圖Fig. 7 Canonical correlation analysis of the 10 physicochemical factors that significantly differed between young and old PMs versus microbial communities in them

新老窖泥具有顯著性差異的理化因子與窖泥菌群OTU之間的CCA如圖7所示，2 個主成分可以解釋56.78%微生物菌群的變異。乙醇、乳酸、丙酸、己酸乙酯、總酯和可溶性Ca2+含量與新窖泥菌群呈正相關，表明與老窖泥相比，新窖泥中乙醇、乳酸、丙酸、己酸乙酯、總酯和Ca2+含量相對較多，推測新窖泥菌群中降解乙醇、酸（乳酸、丙酸）和酯的菌相對較少，酸和醇的存在，形成了更多的酯，如己酸乙酯在新窖泥中含量相對老窖池較多，與陳彬等[18]的研究結果一致。乙酸、銨態氮、pH值和K+含量與老窖泥菌群呈正相關，表明老窖泥中乙酸、銨態氮和pH值相對較高，說明老窖池中代謝形成乙酸、銨態氮的菌較多，同時對酸的降解和銨態氮的合成使得老窖池中pH值升高。新窖泥中存在更多的Ca2+，且已知新窖泥和退化窖泥中常有乳酸鈣結晶析出的情況[19]發生，推測可能與新窖泥的偏酸性環境有關，尤其是其中存在大量的乳酸，促進了窖泥環境中固態鈣與乳酸之間發生酸解，產生更多游離態Ca2+，同時生成的乳酸鈣由于溶解度較低而析出。老窖泥中較高濃度的K+的存在有可能與其中細菌通過運輸系統積累K+有關[20]。

3 討論與結論

各種理化性質中，老窖泥的pH值、銨態氮、乙酸和K+含量相對較高；新窖泥的乙醇、丙酸、乳酸、己酸乙酯、可溶性Ca2+和總酯含量相對較高。新老窖泥理化性質的差異造成了新老窖泥菌群生存環境的差異。新窖泥中Lactobacillus的相對豐度（39.69%）幾乎是老窖泥中相對豐度（5.97%）的7 倍。與新窖泥相比，老窖泥中豐度排名第4～8位的Clostridium（2.87% vs 8.16%）、Aminobacterium（0.015% vs 10.26%）、Syntrophomonas（0.34% vs 7.42%）、Methanoculleus（0.25% vs 7.37%）和Sedimentibacter（0.62% vs 6.43%）相對豐度差異百分比總和達到35.54%，彌補了老窖泥中缺失的Lactobacillus相對豐度。新老窖泥細菌菌群的組成存在巨大差異必然導致新老窖泥菌群的代謝功能存在差異。比如，Lactobacillus代謝產生乳酸且耐酸[21]，很可能與新窖泥中的高乳酸含量和低pH值特性有關；Aminobacterium[14-15]和Sedimentibacter[17]具有降解氨基酸的功能，很可能與老窖泥中銨態氮的增加有關。老窖泥中含量相對較高的Clostridium[22]、Aminobacterium[14]、Syntrophomonas[23]、Sedimentibacter[17]、Methanoculleus[24]菌屬，其適宜生存pH值比乳酸菌高，所以更宜在pH值稍高的老窖泥中生存。本研究通過高通量測序得到的新老窖泥的菌群結構與Liang Huipeng等[7]通過PCR-DGGE得到的菌群規律基本一致，除本研究老窖泥中Actinobacteria相對豐度顯著低于新窖泥這一點，而Liang Huipeng等[7]指出老窖泥中Actinobacteria相對豐度高于新窖泥，并可以將其作為區分新老窖泥的依據。不過，本研究認為Liang Huipeng等[7]通過PCR絕對定量得到的數據與本研究得到的相對定量數據并無本質差異。很可能老窖泥中Actinobacteria的絕對含量值較高[25]，而新窖泥中Actinobacteria的相對定量值較高。

新老窖泥菌群組成的轉變除直接表現在種屬含量變化，還有其內部關系變化和代謝功能變化。新窖泥菌群內部關系相對簡單，主要表現在其中相對豐度占絕對優勢的乳酸菌所在的I組（56.42%）與II組（25.93%）呈強烈負相關。其可能與乳酸菌的產乳酸和產細菌素[26-27]功能有關，乳酸和細菌素的抑菌功能有助于乳酸菌在菌群競爭中占優勢。同時低pH值環境不適于不耐酸菌株的生存。老窖泥菌群的內部關系相對復雜。新窖泥中排名第1的OTU（BN1_denovo2919_g_Lactobacillus）在老窖泥中排名第7，相對豐度由31.67%變為2.88%，盡管其所在的E組與其余各組之間多呈負相關，但其含量太少，影響較小。新窖泥排名第2的OTU（BN2_denovo3167_g_Ruminococcus），在老窖泥排名第1，其與BN1_denovo2919_g_Lactobacillus在新窖泥中的正相關轉變為老窖泥中負相關。兩者相關關系的改變可能與代謝功能的轉變有關。現已知瘤胃菌科的某些菌屬[28-29]在pH 5.0～6.5具有降解乳酸生成己酸的功能。有些乳酸菌如L. buchneri，可以在pH值低于5.8的條件下降解乳酸生成乙酸和1,2-丙二醇[30]。有些梭菌如克氏梭菌[31]，在pH 5.5～7.5具有以乙醇和乙酸為碳源生成己酸的功能。隨著窖泥老熟，pH值逐漸升高，糖類匱乏但乳酸豐富，使得各種菌共同降解乳酸，成為競爭關系。同時，降解乳酸的行為又促進了pH值的進一步升高。另外，一些厭氧菌在與甲烷菌共存時降解脂肪酸生成乙酸和氫氣[32]， 兩者為協作關系。甲烷菌被認為是濃香型老窖泥的標志性菌[33]，老窖泥中很多菌與甲烷菌具有正相關關系 （圖6）。同時，甲烷菌等產氣菌產生的厭氧氣體為窖泥中的厭氧菌創造了更適宜的厭氧生存環境。最終，乳酸菌在老窖泥的菌群競爭中趨于劣勢。

窖泥老熟過程中，窖泥菌群逐漸適應并改造理化環境，其自身也發展壯大。現已知，安徽北部地區濃香型窖池，50 a窖齡窖泥的細菌總量比10 a窖齡窖泥的細菌總量多4 個數量級[25]。窖泥菌群數量越多，其代謝功能越強。窖泥中營養物質主要來源于黃水。與新窖泥菌群呈正相關的乳酸、乙醇、丙酸和己酸乙酯黃水中含量豐富，說明新窖泥菌群對各組分的代謝能力差；而乙酸和銨態氮等二次代謝產物與老窖泥菌群正相關，說明老窖泥菌群代謝功能強，其中相應代謝產物含量較多。以己酸乙酯為例，其由己酸和乙醇酯化形成。老窖泥菌群降解己酸和乙醇的功能強，使己酸乙酯的酯化平衡向分解方向進行。所以，老窖泥中己酸乙酯含量相對較少。老窖泥中總酯含量相對較少，也是同樣的原因。一些理化性質，如pH值，與窖泥菌群的相關性分析結果也正體現了窖泥菌群的作用結果。

綜上所述，在周期性發酵作用的影響下，窖泥菌群的變化與理化環境的變化相互適應，相互影響，共同轉變。新老窖泥理化性質的差異體現了窖泥菌群對窖泥的作用效應。在窖泥菌群作用過程中，其代謝功能也逐漸發生適應性改變。本研究深入解讀新老窖泥菌群的差異并分析其轉變原因，為窖泥的改良提供了理論依據。