鹽脅迫促進鼠李糖乳桿菌富硒的效果

徐 穎，鄔淑芳，楊芙蓮，余海霞，賀佳璇

（陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西 西安 710021）

硒是人體必需的微量營養素，隨著人們對硒營養功能的研究發現，硒不僅是谷胱甘肽過氧化物酶、硒磷酸酯合成酶等酶活性中心的組成成分，還具有保護心血管和心肌的健康、增強免疫功能、防癌抗癌、重金屬的天然解毒劑等作用，并且能促進身體生長、保護視覺器官[1-4]。 硒的補充主要有無機硒和有機硒兩種形式，有機硒相比無機硒，安全性相對較高，不易發生硒中毒，也容易被機體吸收利用[5]。

有益微生物對于硒的富集和轉化是當前乃至以后研究的方向。Sarathchandra等[6]研究巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）富硒效果，發現生成了紅色硒單質。此外，深紅螺菌（Rhodospirillum rubrum）[7]、 大腸桿菌（Escherichia coli）[7]、印度脫硫元螺菌（Desulfurispirillum indicum）[8]、酵母菌[9]、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）[10]等也具有將亞硒酸鹽或硒酸鹽轉化為硒單質的能力。乳酸菌同樣具有將無機硒生物轉化成有機硒的功能[11-14]，相對于化學法，操作簡便、安全，但存在富硒量偏低的問題。所以，本課題在前期研究的基礎上，探討鹽脅迫對鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus）富硒效果的影響，提高鼠李糖乳桿菌富硒量，探索其作用機制，以期對富硒乳酸菌在乳品工業的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌ATCC 53103由實驗室提供；亞硒酸鈉 山東西亞化學工業有限公司；MRS培養基 北京陸橋技術股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

722E型分光光度計 上海光譜儀器有限公司；臺式 低速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；PB-10酸度計 德國賽多利斯公司；H-7650透射電子顯微鏡 日本日立公司；EDAX透射電鏡專用能譜儀 美國伊達克斯有限公司；IRIS Intreid II電感耦合等離子發射光譜儀 美國Thermo Fisher公司；FD5-series真空冷凍干燥機 美國Freeze Dryer公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

將0.3～0.5 mL經高溫高壓滅菌后的MRS肉湯培養基注入該菌凍干管中，用移液槍輕輕吹打，使之充分溶解成菌懸液。將菌懸液移入試管，37 ℃活化培養24 h，連續活化3 代，作為供試菌液。

1.3.2 鹽脅迫富硒培養

一定質量分數的NaCl溶液、0.17 mg/mL亞硒酸鈉溶液和MRS液體培養基預先滅菌，將供試菌液以1%接種量接種于液體培養基中，15 mL培養基加入1 mL亞硒酸鈉和1 mL NaCl溶液，使亞硒酸鈉質量濃度為10 μg/mL，同時做空白對照，37 ℃恒溫靜置培養72 h，采用比濁法，每隔3 h取出在600 nm波長處測定吸光度，繪制各菌種生長曲線，觀察菌體生長情況，以確定鹽脅迫富硒培養的時間。

1.3.3 富硒培養條件優化

1.3.3.1 NaCl質量分數的選擇

2%、4%、6%、8% NaCl溶液和0.17 mg/mL亞硒酸鈉溶液、MRS液體培養基預先滅菌，將供試菌液以1%接種量接種于不同含鹽量富硒液體培養基中，以富硒不加鹽脅迫為的空白對照，37 ℃恒溫靜置培養48 h，觀察菌體顏色變化，用生理鹽水充分洗滌，離心得菌泥，測定菌體富硒率和富硒量。

1.3.3.2 pH值的選擇

配制pH值分別為5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2的MRS液體培養基和0.17 mg/mL亞硒酸鈉溶液、6% NaCl溶液并預先滅好菌，將供試菌液按1%接種量接種于液體培養基中，37 ℃恒溫靜置培養48 h，用生理鹽水充分洗滌，離心得菌泥，測定菌體富硒量和富硒率。

1.3.3.3 培養溫度的選擇

配制一定質量分數的NaCl溶液、0.17 mg/mL亞硒酸鈉溶液和pH值為最佳值MRS液體培養基并預先滅菌，將供試菌液以1%接種量接種于含最佳NaCl質量分數富硒液體培養基中，分別在35、37、39、41、43 ℃條件下恒溫靜置培養48 h。離心得菌泥，測定菌體富硒量和富硒率。

1.3.4 富硒量的測定

菌液離心得菌體， 烘干后用硝酸- 高氯酸 （5∶1，V/V）混酸消化，方法詳見文獻[15]。樣品用電感耦合等離子發射光譜儀測定。富硒量和富硒率按 式（1）、（2）計算：

1.3.5 透射電鏡觀察富硒菌體

富硒后菌體離心，用2.5%戊二醛-多聚甲酸固定液4 ℃固定2 h，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液浸洗30 min；1%四氧化鋨固定液4 ℃固定2 h，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液10 min；依次用30%、50%、70%、90%乙醇、無水乙醇脫水；用包埋劑（Epon812-丙酮1∶1）37 ℃浸泡2 h，再用包埋劑60 ℃浸泡0.5～1 h；37 ℃聚合12 h，超薄切片50～70 nm；用醋酸鈾、檸檬酸鉛染色各10 min。用透射電鏡觀察，用能譜儀打能譜。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫富硒鼠李糖乳桿菌生長曲線

如圖1所示，兩個實驗組比空白組進入穩定期的時間推后3 h左右，這是由于在對數生長期（3～12 h）菌體的生長一定程度上受到鹽脅迫和硒的抑制，但進入穩定期后各組的差異逐漸縮小，6% NaCl溶液脅迫條件下富硒培養24 h，活菌數接近空白組，且比未受鹽脅迫組的活菌數高。說明6% NaCl溶液脅迫雖然對菌前期生長有些影響，但是進入穩定期后影響不大，可以開展后續實驗。

圖 1 鼠李糖乳桿菌受6% NaCl溶液脅迫的生長曲線Fig. 1 Growth curve of L. rhamnosus under 6% NaCl stress

2.2 鹽脅迫工藝條件對鼠李糖乳桿菌富硒效果的影響

2.2.1 培養時間的影響

圖 2 培養時間對富硒量（a）和富硒率（b）的影響Fig. 2 Effect of culture time on selenium content (a) and enrichment efficiency (b)

由圖2可知，用6% NaCl溶液脅迫鼠李糖乳桿菌，24 h內隨菌的生長，富硒量和富硒率快速增大，但受6% NaCl溶液脅迫組與未受鹽脅迫組富硒作用差異不大；培養24 h后，菌體處于穩定期，富硒量和富硒率變化緩慢，趨于穩定，但受6% NaCl溶液脅迫組與未受鹽脅迫組富硒作用差異逐漸增大?？傊?，菌體的富硒作用與其生長同步進行。48 h后，富硒量和富硒率波動變小，因此確定培養時間為48 h。此時6% NaCl溶液脅迫組比未脅迫組的富硒量提高了122.72 μg/g，富硒率提高了13.17%，明顯促進了鼠李糖乳桿菌的富硒效果。

2.2.2 NaCl質量分數的影響

由圖3可知，未脅迫組的富硒量和富硒率分別為329.71 μg/g和30.16%，6% NaCl溶液脅迫組的富硒量和富硒率高于未脅迫組，能提高鼠李糖乳桿菌的富硒效果，且在NaCl質量分數6%時富硒量和富硒率達最高值。

圖 3 NaCl質量分數對富硒效果的影響Fig. 3 Effect of salt concentration on selenium content and enrichment efficiency

2.2.3 培養pH值的影響

圖 4 pH值對富硒量（a）和富硒率（b）的影響Fig. 4 Effect of pH on selenium content (a) and enrichment efficiency (b)

由圖4 可以看出，用6% N a C l 溶液脅迫富硒，pH 5.6～6.4時，富硒量和富硒率呈現不同程度的遞增，但是在pH 6.4～7.2時，富硒量和富硒率呈現下降趨勢，說明pH值大于6.4有明顯抑制菌體富硒的作用，可能是因為pH值大于6.4后，對酶活力有影響，影響硒蛋白的合成，從而抑制菌體富硒作用，所以鹽脅迫富硒培養的最佳pH值為6.4。

2.2.4 培養溫度的影響

由圖5可知，富硒培養受溫度變化影響比較明顯，在6% NaCl溶液脅迫富硒培養條件下，37 ℃時呈現最大值，只富硒不進行鹽脅迫培養條件下39 ℃時出現最大值，可能是由于37 ℃是鼠李糖乳桿菌的最佳生長溫度，加鹽改變細胞通透性使富硒量增加，不加鹽時溫度升高造成細胞的損傷，所以溫度過高時富硒量反而減少。因此，鼠李糖乳桿菌在進行鹽脅迫富硒培養效果較好的溫度為37 ℃。

圖 5 培養溫度對富硒量（a）和富硒率（b）影響Fig. 5 Effect of culture temperature on selenium content (a) and enrichment efficiency (b)

2.3 透射電鏡觀察

圖 6 鼠李糖乳桿菌富硒前后形貌及能譜對比Fig. 6 Comparison of morphology and energy spectra of native and Se-enriched L. rhamnosus

富硒后的菌體細胞內有黑色微小球形顆粒分布 （圖6B1），鹽脅迫富硒后的菌體細胞內外均有黑色微小球形顆粒分布，顆粒數較單純富硒的情況多，并且在細胞外的顆粒可以游離存在，顆粒大小20～60 nm（圖6C1）。 Wadhwani等[16]指出大概有30多種原核微生物能把無機硒轉化成硒單質，顆粒大小主要集中在20～200 nm，顆粒大小與富硒培養時間有關。本次觀察到的顆粒大小正好位于其間。經能譜分析，空白組硒質量分數為0.03%（圖6A2），富硒未脅迫組硒質量分數為0.42% （圖6B2），鹽脅迫富硒組硒質量分數為0.72%（圖6C2）。 說明亞硒酸鈉能夠進入到菌體內，被還原生成硒單質，有一部分留在細胞內，另外還有一部分被分泌到細胞外，并且可以游離存在，菌體受鹽脅迫后富硒量增加，進一步證明了鼠李糖乳桿菌具有生物轉化無機硒的作用。

3 討 論

具有富硒能力的乳酸菌有鼠李糖乳桿菌[17]、副干酪乳桿菌[17]、保加利亞乳桿菌[18]、干酪乳桿菌[19]、羅伊氏乳桿菌[20-21]、耐久腸球菌[22]等。靳志強等[23]研究了動物雙歧桿菌01的耐硒特性和最佳富硒條件，其菌體硒含量達898.0 μg/g，富硒率為28.1%。曾議霆等[24]對5 種15 株乳酸菌進行富硒培養并篩選，最終篩選出1 株植物乳桿菌BC-25為富硒優勢菌株，富硒量425.8 μg/g，富硒率達27.0%。文獻[23]中動物雙歧桿菌01的富硒量雖然高于本研究的鼠李糖乳桿菌，但其富硒率較低。文獻[24]篩選出的植物乳桿菌的富硒量和富硒率均低于于本研究的鼠李糖乳桿菌。

硒酸鹽或亞硒酸鹽在微生物中被還原成硒單質，可以看成是脫毒的過程，同時作為電子的受體，維持氧化還原穩定狀態[25]。谷胱甘肽在亞硒酸還原中起電子供體的作用，其還原產物是硒代谷胱甘肽（GS-Se-SG），它是谷胱甘肽還原酶和細菌硫氧還蛋白還原酶的底物。谷胱甘肽還原酶或細菌硫氧還蛋白還原酶還原GS-Se-SG產生谷胱甘肽硒硫化物（GS-Se—），其進一步轉化為還原型谷胱甘肽和Se0。谷胱甘肽再生的電子源是NADPH。Butler等[26]報道硒納米球分泌到細胞外過程中起作用的是SefA（硒因 子A），它的分子質量約為95 kDa，沒有可切割的信號肽。

楊鶴[27]發現NaCl能提高乳酸菌的富硒能力，和本課題組的研究結果一致。乳酸菌能將培養液中的無機硒轉化成其所需要的硒代半胱氨酸[28]，進一步合成各種含硒酶類，維持機體正常代謝，當乳酸菌受到鹽脅迫時，為應對外界滲透壓的變化，通過誘導相關酶（包括硒蛋白酶）表達上調，增加谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和甜菜堿等可混溶性溶質的生成量，這些可混溶性溶質能防止由于外部高滲透壓而引起的細胞內水分損失，確保細胞內外的溶脹平衡，維持蛋白結構的穩定性[29]。而這些可混溶性溶質生物合成的關鍵酶如甘氨酸還原酶、脯氨酸還原酶、甜菜堿還原酶都是硒蛋白酶，因此鹽脅迫促進了乳酸菌對硒的轉化作用。

4 結 論

以1 株富硒能力較強的鼠李糖乳桿菌（ATCC 53103）為研究對象，利用電感耦合等離子發射光譜方法測定鼠李糖乳桿菌的富硒量和富硒率，研究鹽脅迫富硒過程中培養時間、NaCl質量分數、pH值、培養溫度對菌體細胞富硒效果的影響，結果表明，15 mL培養基中加入1 mL 6% NaCl溶液、pH 6.4、溫度37 ℃時，鼠李糖乳桿菌富硒培養48 h效果較好，富硒量最高可達452.43 μg/g，富硒率最高達43.33%，利用透射電鏡觀察發現鼠李糖乳桿菌富硒后形成微小硒納米顆粒，且鹽脅迫能促進其富硒效果。