楓香擬莖點(diǎn)霉B3生物轉(zhuǎn)化花生廢棄物 合成白藜蘆醇

劉連紅，陳 飛，管永祥，仇美華，張 麗，戴傳超,

（1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇省微生物與功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心， 江蘇 南京 210023；2.江蘇省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，江蘇 南京 210008；3.江蘇省耕地質(zhì)量保護(hù)與環(huán)境監(jiān)測(cè)站，江蘇 南京 210008）

白藜蘆醇是一種多酚類化合物，存在于虎杖、花生、葡萄、桑葚等植物中[1]。白藜蘆醇也被認(rèn)為是一種植物抗毒素，在植物受到生物或非生物脅迫時(shí)產(chǎn)生[2]。近年來(lái)，白藜蘆醇在醫(yī)藥及保健食品方面的應(yīng)用發(fā)展引起了人們的極大興趣。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗菌消炎、調(diào)節(jié)油脂代謝、保護(hù)心臟血管等功能[3-4]，被譽(yù)為繼紫杉醇之后的又一新的綠色抗癌藥物[5]。目前，獲取白藜蘆醇的主要途徑之一是采用有機(jī)溶劑從虎杖中提取[6]，但該法提取率低且受到虎杖植物資源的限制。近幾年利用轉(zhuǎn)基因微生物生產(chǎn)白藜蘆醇是另一種被廣泛研究的方法[7]，但在該體系中誘導(dǎo)白藜蘆醇的合成不僅時(shí)限較長(zhǎng)而且成本較高。

花生是含有白藜蘆醇的最重要的可食用植物之一，國(guó)內(nèi)外有關(guān)于花生中白藜蘆醇的大量研究[8-9]。據(jù)報(bào)道，花生中含有許多對(duì)健康有益的天然活性化合物，如芪類、黃酮類、酚酸類和植物固醇類等[10-12]。目前世界花生消費(fèi)一是油用，二是食用[13]。長(zhǎng)期以來(lái)，人們僅重視花生仁的利用，而忽視花生殼、紅衣、根莖葉等利用。花生植株除了胚、上胚軸、根尖和黏液外其他各部位均含有白藜蘆醇[14]，它主要通過(guò)苯丙氨酸代謝途徑合成。花生體內(nèi)可合成白藜蘆醇，植株中必然有其前體物質(zhì)的大量存在，比如對(duì)香豆酸。另外，植物中白藜蘆醇一般與糖結(jié)合以白藜蘆醇苷的形式存在，近幾年，研究表明微生物可以通過(guò)分泌β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，GLU）轉(zhuǎn)化苷元合成白藜蘆醇[15-16]。因此，結(jié)合微生物轉(zhuǎn)化法探索出一條高效、綠色的生產(chǎn)路徑，即將花生廢棄物中的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，在之后的回收過(guò)程中，將不僅回收花生廢棄物已經(jīng)存在的一部分產(chǎn)品，還能額外增加一部分生物轉(zhuǎn)化而來(lái)的白藜蘆醇。

內(nèi)生真菌是指生長(zhǎng)于植物組織細(xì)胞間、宿主不表現(xiàn)出感染癥狀的一類真菌[17]。前期研究發(fā)現(xiàn)，接種內(nèi)生真菌楓香擬莖點(diǎn)霉（Phomopsis liquidambari）B3可加速花生殘茬秸稈的腐解和緩解花生連作障礙[18-20]。近期全基因測(cè)序結(jié)果表明楓香擬莖點(diǎn)霉B3含有白藜蘆醇合成途徑中關(guān)鍵酶GLU、4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumarate CoA ligase，4CL）和白藜蘆醇合酶（stilbene synthase，STS）的基因。因此，本研究首先通過(guò)代謝物檢測(cè)和關(guān)鍵基因的定量實(shí)驗(yàn)探究楓香擬莖點(diǎn)霉B3利用花生廢棄物合成白藜蘆醇的初步機(jī)理。在此基礎(chǔ)上，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化使白藜蘆醇含量最大化，以期為花生廢棄物中白藜蘆醇的開發(fā)和利用提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生（Archis hypogaea）采用江西省鷹潭市常規(guī)品種贛花5號(hào)。

花生廢棄物：2016年9月收獲贛花5號(hào)花生，將花生秸稈和花生殼樣品清洗晾干，用小型高速粉碎機(jī)粉碎，即得到花生廢棄物粉末，過(guò)60 目篩備用。

內(nèi)生真菌楓香擬莖點(diǎn)霉B3分離自大戟科植物重陽(yáng)木（Bischofia polycarpam）莖內(nèi)皮，保存于南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物資源與生態(tài)實(shí)驗(yàn)室，馬鈴薯葡萄糖固體斜面4 ℃保藏。

白藜蘆醇、白藜蘆醇苷和對(duì)香豆酸等標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；甲醇（色譜級(jí)）和其他分析純?cè)噭?中國(guó)江蘇漢邦科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1100型高效液相色譜儀、1290 Infinity LC/6460 QQQ MS型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫有限公司；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR）儀 美國(guó)Applied Biosystems公司；5 L小型發(fā)酵罐及其配件（溶解氧電極、pH電極及空氣過(guò)濾膜等配件） 上海聯(lián)環(huán)生物工程設(shè)備有限公司；6202小型高速粉碎機(jī) 北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝

種子液培養(yǎng)基：將楓香擬莖點(diǎn)霉B3從馬鈴薯葡萄糖固體斜面培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接至馬鈴薯葡萄糖液體（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)36 h用作種子液。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方：馬鈴薯浸提液200 g/L，葡萄糖20 g/L，花生廢棄物（花生秸稈-花生殼5∶1，記作PS）50 g/L，pH 7.0，培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min。

為探究接種楓香擬莖點(diǎn)霉B3對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中白藜蘆醇含量的影響，設(shè)置2 個(gè)處理：未接種B3的發(fā)酵培養(yǎng)基（CK）和接種B3的發(fā)酵培養(yǎng)基（B3）。發(fā)酵工藝：將B3種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，以培養(yǎng)基初始pH 7.0、料液比1∶20（g/mL）、接種量5%（生物量（3.40±0.28）g/L）、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵轉(zhuǎn)速 150 r/min為初始條件，避光振蕩培養(yǎng)。收集樣品放置于-80 ℃過(guò)夜，使用冷凍干燥機(jī)運(yùn)行24 h凍干后添加30 mL甲醇超聲輔助（100 Hz，45 ℃，30 min）提取，4 500 r/min離心15 min收集上清液，65 ℃旋蒸至干，最后用1 mL甲醇溶解備用。

1.3.2 生物轉(zhuǎn)化單因素試驗(yàn)

按照1.3.1節(jié)發(fā)酵條件，以發(fā)酵培養(yǎng)基中白藜蘆醇含量為測(cè)定指標(biāo)，進(jìn)一步考察料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL））、培養(yǎng)基初始pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、接種量（1%、3%、5%、7%、9%、11%）、發(fā)酵溫度（20、24、28、32、36、40 ℃）和發(fā)酵轉(zhuǎn)速（90、120、150、180、210、240 r/min）對(duì)白藜蘆醇含量的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定料液比1∶30（g/mL），以培養(yǎng)基初始pH值、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵轉(zhuǎn)速為試驗(yàn)因素，以白藜蘆醇增量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)，因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表 1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for response surface methodology

1.3.4 發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)

選取5 L發(fā)酵罐進(jìn)行中試放大實(shí)驗(yàn)，其中發(fā)酵條件按照響應(yīng)面最終優(yōu)化條件設(shè)置培養(yǎng)基初始pH值、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵轉(zhuǎn)速，其余條件按照實(shí)際條件如通氣量1.5～3 m3/min和壓力0.7 kg/cm2培養(yǎng)48 h后放罐。

1.3.5 分析方法

1.3.5.1 花生廢棄物中物質(zhì)的鑒定

質(zhì)譜條件：安捷倫C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相使用甲醇（A泵）和0.2%冰醋酸（B泵）進(jìn)行梯度洗脫；梯度洗脫：0～20 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)從5%上升到 50%；20～40 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)升到80%；40～80 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)升到100%；紫外吸收波長(zhǎng)280 nm；流速0.2 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.5.2 白藜蘆醇含量的測(cè)定[21]

色譜條件：安捷倫C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），紫外吸收波長(zhǎng)為306 nm；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為乙腈-超純水（30∶70，V/V），流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.5.3 總糖和GLU活性的檢測(cè)

總糖測(cè)定采用蒽酮-硫酸比色法[22]；GLU活性測(cè)定參考Kuo等[23]方法。

1.3.5.4 關(guān)鍵酶基因表達(dá)的檢測(cè)

為確定合成過(guò)程中GLU、4CL和STS基因的轉(zhuǎn)錄水平，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了2 個(gè)處理組：在添加花生廢棄物的PDB中接種B3（PDB+PS+B3）和未添加花生廢棄物的PDB中接種B3（PDB+B3）。在每個(gè)取樣點(diǎn)收集大約0.1 g真菌菌絲（濕質(zhì)量），并用蒸餾水洗滌。研磨真菌菌絲并用TRIZOL試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA）取總RNA[24]。使用EasyScript RT試劑盒（TransGen Biotech）將提取的總RNA合成cDNA。使用real-time PCR儀StepOne系統(tǒng)（Applied Biosystems）進(jìn)行real-time PCR。反應(yīng)混合液（20 μL）包括10 μL SYBR Green探針（AceQ qPCR SYBR Green Master Mix (High ROX Premixe)，Vazyme）、2 μL cDNA模板和上下游引物各0.4 μL。基于B3中GLU、4CL和STS基因的部分或全長(zhǎng)mRNA序列分別設(shè)計(jì)了特異性引物對(duì)（GLU-F-q/GLU-R-q、4CL-F-q/4CL-R-q 和STS-F-q/STS-R-q），以B3的β-actin基因作為表達(dá)水平的內(nèi)參基因，具體引物對(duì)見表2。real-time PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 min；循環(huán)反應(yīng)95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)；融解曲線：95 ℃、15 s，60 ℃、60 s和95 ℃、15 s。使用標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線驗(yàn)證擴(kuò)增的特異性。使用StepOne software（version 2.0，Applied Biosystems）確定熒光通過(guò)循環(huán)閾值（Ct）的周期數(shù)，這個(gè)值被用于表達(dá)水平的定量。通過(guò)2-ΔΔCt方法分析cDNA樣品的相對(duì)表達(dá)水平。每個(gè)樣品都設(shè)置3 次重復(fù)。

表 2 實(shí)驗(yàn)使用引物Table 2 Sequences of oligonucleotide primers used for real-time PCR in this study

1.4 數(shù)據(jù)分析

響應(yīng)面采用Design-Expert V11.0軟件，其他數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0和Excel 2016進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件中的One-way ANOVA進(jìn)行分析，并用Tukey多重比較不同處理組間的顯著性差異（P＜0.05，差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種楓香擬莖點(diǎn)霉B3對(duì)發(fā)酵液中白藜蘆醇含量的影響

字母不同表示差異顯著（P＜0.05），下同。

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，CK組中白藜蘆醇含量呈持續(xù)下降趨勢(shì)，這是因?yàn)榘邹继J醇不穩(wěn)定易受外界環(huán)境的影響[25]。而接種B3處理組中白藜蘆醇含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，時(shí)間從0 h延長(zhǎng)至36 h時(shí)，白藜蘆醇含量上升至最大值38.34 μg/g，當(dāng)繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，白藜蘆醇含量開始逐漸下降至保持穩(wěn)定，這說(shuō)明時(shí)間過(guò)長(zhǎng)菌體會(huì)出現(xiàn)老化而影響白藜蘆醇合成，且與CK相比，36 h之前接種楓香擬莖點(diǎn)霉B3顯著加快白藜蘆醇的合成，36 h之后，B3處理組中白藜蘆醇含量顯著高于CK。因此，總體上看接種B3于36 h可顯著提高花生廢棄物中白藜蘆醇含量。

2.2 花生廢棄物中的物質(zhì)鑒定

為更深入研究楓香擬莖點(diǎn)霉B3對(duì)白藜蘆醇生物轉(zhuǎn)化的途徑，首先需鑒定白藜蘆醇合成的前體物質(zhì)。高效液相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果揭示了花生廢棄物中2 種主要前體物質(zhì)的存在，如對(duì)香豆酸和白藜蘆醇苷（圖2）。因此，推測(cè)楓香擬莖點(diǎn)霉B3既可分泌GLU轉(zhuǎn)化白藜蘆醇苷生成白藜蘆醇，也可分泌4CL和STS利用花生廢棄物中的對(duì)香豆酸合成白藜蘆醇，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖 2 花生廢棄物中白藜蘆醇及其相關(guān)前體物質(zhì)的 高效液相色譜-質(zhì)譜洗脫圖Fig. 2 HPLC-MS profiles of resveratrol, luteolin and related precursors in peanut wastes

2.3 發(fā)酵液中總糖含量和GLU活性的變化

圖 3 發(fā)酵液中接種楓香擬莖點(diǎn)霉B3對(duì)總糖含量和GLU活性的影響Fig. 3 Evolution of total sugar content and β-glucosidase activity during fermentation of peanut wastes with P. liquidambari B3

為驗(yàn)證接種B3的生長(zhǎng)情況和GLU的分泌，每隔12 h檢測(cè)總糖和GLU活性（圖3）。結(jié)果顯示，PBD+PS+B3 處理組中總糖從12 h之后急劇下降至36 h后保持穩(wěn)定，而PBD+PS對(duì)照組無(wú)顯著性差異，表明楓香擬莖點(diǎn)霉B3在該時(shí)間段有最大生長(zhǎng)速率；另外通過(guò)對(duì)GLU活性的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)24～36 h急劇上升后保持穩(wěn)定，結(jié)果說(shuō)明：楓香擬莖點(diǎn)霉B3在轉(zhuǎn)化過(guò)程中能夠分泌GLU，同時(shí)GLU活性依賴于B3的生長(zhǎng)。

2.4 關(guān)鍵酶基因的表達(dá)和推測(cè)合成途徑

圖 4 楓香擬莖點(diǎn)霉B3中GLU（A）、4CL（B）和STS（C）的 相對(duì)表達(dá)情況Fig. 4 Relative expression levels of GLU (A), 4CL (B) and STS (C) in P. liquidambari B3

為進(jìn)一步闡明楓香擬莖點(diǎn)霉B3合成白藜蘆醇的代謝途徑，通過(guò)real-time PCR測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)3 種關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄水平。圖4A顯示，PDB+B3處理組相對(duì)CK（12 h）表達(dá)水平無(wú)顯著性差異，而PDB+PS+B3處理組中GLU基因表達(dá)水平呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，總體來(lái)說(shuō)，在36 h時(shí)間段內(nèi)PDB+PS+B3處理組中基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)較高，結(jié)合GLU活性，說(shuō)明B3在36 h內(nèi)能釋放GLU轉(zhuǎn)化白藜蘆醇苷合成白藜蘆醇。另外，圖4B、C顯示，在每個(gè)時(shí)間段下，處理組中4CL和STS基因表達(dá)與CK（12 h）相比均成上調(diào)趨勢(shì)，并且在36 h時(shí)間段內(nèi)4CL基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)較高，而在24、36 h和48 h內(nèi)的STS基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)均較高，說(shuō)明在該時(shí)間范圍內(nèi)，STS釋放量較高，與白藜蘆醇含量變化一致，楓香擬莖點(diǎn)霉B3可分泌4CL和STS利用對(duì)香豆酸轉(zhuǎn)化合成白藜蘆醇。基于以上結(jié)果，推測(cè)楓香擬莖點(diǎn)霉B3生物轉(zhuǎn)化花生廢棄物合成白藜蘆醇的途徑見圖5，但具體途徑的轉(zhuǎn)化率尚有待進(jìn)一步研究。

圖 5 楓香擬莖點(diǎn)霉B3生物轉(zhuǎn)化花生廢棄物合成白藜蘆醇的推測(cè)途徑Fig. 5 Speculative synthesis pathway of resveratrol from P. liquidambari B3-biotransformed peanut wastes

2.5 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖 6 料液比（A）、培養(yǎng)基初始pH值（B）、發(fā)酵溫度（C）、 發(fā)酵轉(zhuǎn)速（D）和接種量（E）對(duì)白藜蘆醇含量的影響Fig. 6 Effects of radio of liquid to solid (A), initial pH of fermentation medium (B), culture temperature (C), rotating speed (D) and inoculum volume (E) on the content of resveratrol

接種楓香擬莖點(diǎn)霉B3可轉(zhuǎn)化花生廢棄物合成白藜蘆醇，因此，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)確定不同發(fā)酵條件的影響。圖6A表明，不同料液比條件下，CK組中白藜蘆醇含量無(wú)顯著性差異，而B3處理組中白藜蘆醇含量均提高到2 倍左右，且在料液比為1∶30時(shí)最高，達(dá)到38.96 μg/g，這可能是菌株分泌酶量有限導(dǎo)致。從圖6B可以看出，在不同pH值條件下，CK組中白藜蘆醇含量近乎無(wú)顯著性差異，而當(dāng)pH值為中性和堿性時(shí)B3處理組中白藜蘆醇含量明顯低于酸性條件，因?yàn)榛ㄉ邪邹继J醇在酸性條件下較為穩(wěn)定，而堿性條件下易變性[26]。圖6C～E結(jié)果表明，發(fā)酵溫度、發(fā)酵轉(zhuǎn)速和接種量對(duì)白藜蘆醇含量的影響相似，表現(xiàn)為先增加后下降。原因分別為：溫度對(duì)白藜蘆醇含量的影響與菌株的溫度適應(yīng)性有關(guān)[27]，即與楓香擬莖點(diǎn)霉B3生長(zhǎng)的最適溫度相同（28 ℃）；在本研究采用的發(fā)酵條件中，低接種量導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，而過(guò)大的接種量可能表現(xiàn)為細(xì)胞降解，從而導(dǎo)致一定時(shí)期內(nèi)細(xì)胞質(zhì)量的降低；白藜蘆醇含量在較高轉(zhuǎn)速下降可能是由于白藜蘆醇不穩(wěn)定或在氧氣存在下產(chǎn)生較低量的白藜蘆醇，因?yàn)楦咿D(zhuǎn)速會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)過(guò)程中的高含氧量[28]。因此綜合考慮，在料液比1∶30條件下，選取培養(yǎng)基初始pH 5.0、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵轉(zhuǎn)速210 r/min和接種量9%為響應(yīng)面優(yōu)化時(shí)自變量的0水平。

2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在各單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以白藜蘆醇增量（Y）作為響應(yīng)值，以培養(yǎng)基pH值（X1）、接種量（X2）、發(fā)酵溫度（X3）和發(fā)酵轉(zhuǎn)速（X4）作為自變量，建立4因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。利用Design-Expert設(shè)計(jì)統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共29 組，所得結(jié)果如表3所示。采用Design-Expert V11.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表 3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Response surface design with experimental results

表 4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model

運(yùn)用Design-Expert軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程如下：Y＝-713.67+97.92X1-9.05X2+23.44X3+2.03 X4+1.66X1X2-0.57X1X3+0.04X1X4+0.21X2X3+0.07X2X4+ 0.02X3X4-10.19X12-1.05X22-0.46X32-0.01X42。

從表4可看出，模擬P值小于0.000 1，表示該回歸模擬高度顯著；失擬項(xiàng)P值為0.119 5，不顯著，說(shuō)明該回歸模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值有較好的擬合水平，所選模型適宜。回歸系數(shù)R2為0.907 3，表明模型較準(zhǔn)確，試驗(yàn)誤差較小，可以對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確分析和預(yù)測(cè)。回歸方程各項(xiàng)的方差分析表明，二次項(xiàng)X22顯著，X3、X12、X32和 X42極顯著。F值越大，表明對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大，結(jié)合方差分析表，對(duì)白藜蘆醇增量影響程度大小順序?yàn)榘l(fā)酵溫度、接種量、培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵轉(zhuǎn)速。

2.6.2 響應(yīng)面分析及驗(yàn)證

圖 7 任意兩變量對(duì)白藜蘆醇增量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig. 7 Contour and response surface plots showing the interactive effects of various variables on increasing resveratrol content

等高線的形狀不同，交互效應(yīng)的強(qiáng)弱也不同。交互項(xiàng)的等高線圖越近似橢圓形，表明交互作用越強(qiáng)[29]。由圖7可以看出，3 組交互作用中，培養(yǎng)基初始pH值與接種量的交互作用最強(qiáng)，其次是接種量與發(fā)酵轉(zhuǎn)速的交互作用，而發(fā)酵溫度和發(fā)酵轉(zhuǎn)速的交互作用最弱。

從響應(yīng)面圖可看到擬合曲面有最大值，對(duì)擬合方程求偏導(dǎo)，可得出模型最大值，即為最優(yōu)方案[30]。通過(guò)對(duì)二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型的解逆矩陣，得出白藜蘆醇增量最高的最佳條件為培養(yǎng)基初始pH 5.167、接種量9.097%、發(fā)酵溫度28.632 ℃、發(fā)酵轉(zhuǎn)速203.643 r/min，預(yù)測(cè)白藜蘆醇增量為40.555 μg/g。結(jié)合實(shí)際操作情況，將發(fā)酵條件修正為培養(yǎng)基初始pH 5.2、接種量9%、發(fā)酵溫度28.6 ℃、發(fā)酵轉(zhuǎn)速204 r/min，在此條件下進(jìn)行3 次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算平均值為39.73 μg/g，該結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值基本一致，相對(duì)誤差為2.024%，說(shuō)明該模型對(duì)試驗(yàn)具有一定的實(shí)際指導(dǎo)意義。后續(xù)實(shí)驗(yàn)為了擴(kuò)大發(fā)酵規(guī)模，選取5 L發(fā)酵罐進(jìn)行中試放大實(shí)驗(yàn)。從圖8可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，白藜蘆醇含量逐漸增加，到第36小時(shí)達(dá)到最大值111.78 μg/g，與未接種楓香擬莖點(diǎn)霉B3時(shí)相比，白藜蘆醇含量提高了1.9 倍。總糖含量逐步下降，說(shuō)明菌絲要先消耗掉葡萄糖后，才能產(chǎn)生合成酶，從而利用白藜蘆醇苷和對(duì)香豆酸產(chǎn)生白藜蘆醇。pH值呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵前期氨基酸等物質(zhì)不斷釋放造成酸性條件，直至36 h合成大量白藜蘆醇，隨后菌體生長(zhǎng)能力下降釋放胞內(nèi)一些堿性物質(zhì)導(dǎo)致pH值逐漸上升。因此36 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖 8 花生廢棄物發(fā)酵罐各跟蹤指標(biāo)Fig. 8 Time courses of fermentation of peanut wastes in a 5 L fermentor

3 結(jié) 論

本研究表明，內(nèi)生真菌楓香擬莖點(diǎn)霉B3既可以通過(guò)分泌糖苷酶轉(zhuǎn)化花生廢棄物中的白藜蘆醇苷為白藜蘆醇，又可以通過(guò)從頭合成途徑利用花生廢棄物中的對(duì)香豆酸生產(chǎn)白藜蘆醇。其中，兩條途徑具體途徑的轉(zhuǎn)化率尚有待進(jìn)一步研究。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)搖瓶試驗(yàn)中內(nèi)生真菌B3生物轉(zhuǎn)化花生廢棄物合成白藜蘆醇的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。建立了pH值、接種量、發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵液中白藜蘆醇含量的二次回歸方程模型，經(jīng)驗(yàn)證，該數(shù)學(xué)模型可靠，可以用于發(fā)酵液中白藜蘆醇含量的預(yù)測(cè)。結(jié)合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化模型的結(jié)果來(lái)看，在料液比1∶30（g/mL）、培養(yǎng)基初始pH 5.2、接種量9%、發(fā)酵溫度28.6 ℃、發(fā)酵轉(zhuǎn)速204 r/min條件下，發(fā)酵液中白藜蘆醇含量提高了39.73 μg/g。在此最優(yōu)條件下，在5 L發(fā)酵罐進(jìn)行中試放大實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示發(fā)酵36 h白藜蘆醇含量提高了1.9 倍。因此開發(fā)花生廢棄物中的白藜蘆醇不僅不會(huì)造成像虎杖中那樣“與藥爭(zhēng)源”的矛盾，而且對(duì)于提高花生的價(jià)值將更加有意義。