不同發酵方式鹽漬蘿卜揮發性成分動態分析

汪冬冬，唐 垚，陳 功,2，李 恒,2，明建英，蔡地烽，王 勇，伍亞龍，張其圣,2,

（1.四川東坡中國泡菜產業技術研究院，四川 眉山 620000；2.四川省食品發酵工業研究設計院，四川 成都 611130）

新鮮蔬菜的鹽（泡）漬貯藏加工起源于中國，并在上千年的發展過程中成為我國最普遍和大眾化的蔬菜加工方法。其中鹽漬菜是一種傳統發酵蔬菜制品的典型代表，其利用以乳酸菌為主的優勢本土益生菌群發酵產酸，形成具有“清香、嫩脆、爽口”特點的蔬菜制品。泡漬與發酵伴隨著一系列復雜的物理、化學和生物反應的變化，產生出柔和的風味與芳香物質成分[1]。受原料、區域、工藝等因素的影響，我國鹽漬菜呈現出多樣化。根據成品形態不同，可分為濕態、半干態和干態3 種，三者之間沒有具體的劃分界線，但都是用鹽直接漬制而成。一般認為，濕態鹽漬是指新鮮蔬菜和水一同添加進行發酵，如四川鹽漬菜、東北酸菜等；半干態是指加工前不添加水直接進行鹽漬，如涪陵榨菜、韓國鹽漬菜等；干態鹽漬是指加工前或加工后進行干燥，如蕭山蘿卜干、宜賓芽菜等[2]。

風味是評價鹽漬菜品質的重要指標，很大程度上決定了消費者的選擇，而不同工藝的產品，風味迥異。濕態鹽漬菜研究中，Xiao Zuobing等[3]通過氣相色譜-聞香法結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）發現泡辣椒含有67 種揮發性化合物，結合多重分析發現主成分為乙酸、2-乙基苯酚、L-芳樟醇、十三烷、丁酸丁酯和3-蒈烯。徐丹萍等[4]研究發現四川泡蘿卜發酵以后主體風味為酯類，主要為1-異硫代氰酸丁酯、異硫氰酸乙酯，相對含量在10%以上。侯曉艷等[5]采用接種發酵和自然發酵對比發現，泡蘿卜中揮發性風味物質主要是烯類、酯類和酮類。Kim等[6]研究韓國鹽漬泡蘿卜中主要為含硫化合物，特征性風味物質為硫氰酸甲酯、己醛、四氫噻吩和苯甲酸苯乙酯。半干態鹽漬菜研究中，Hwang[7]和Hong等[8]研究發現韓國泡菜的主要風味物質為二甲基二硫醚、二甲基三硫醚等含硫化合物。汪冬冬等[9]采用GC-MS研究6 種典型工業鹽漬菜得到174 種揮發性成分，其中乙醇、苯乙醇、 2-乙基己醇、乙酸、丁酸、乙酸乙酯可以用于區分發酵型和非發酵型鹽漬菜。干態鹽漬菜研究中，吳華昌等[10]采用GC-MS對不同發酵時間芽菜的揮發性香氣進行分析，共鑒定出75 個揮發組分，其中醇類、酸類、酯類和烷烴類等化合物為主體香味物質。劉大群等[11]使用電子鼻和GC-MS從風脫水和鹽脫水蕭山蘿卜干中檢測出58 種和35 種揮發性香氣成分，其中風脫水蘿卜干揮發性香氣成分種類高于鹽脫水蘿卜干。

由此可看出，鹽漬菜的風味受工藝、原輔料、微生物等影響。濕態、半干態和干態工藝鹽漬菜為我國的傳統鹽漬菜中的典型工藝，然而目前少見報道3 種發酵方式的鹽漬菜品質特性和揮發性風味成分研究。本實驗以鹽漬菜中常用的蘿卜為原料，通過設定3 種不同水分活度的鹽漬蘿卜模擬濕態、半干態和干態工藝，測定發酵過程中的理化性質、微生物數量和揮發性風味等指標，研究不同發酵方式鹽漬蘿卜發酵過程中揮發性風味成分，為鹽漬蘿卜的加工和風味調控提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2018 年4 月于四川眉山當地農貿市場采購直徑9～11 cm、長度20～25 cm無腐爛及變軟的新鮮長根型白蘿卜約200 kg，總計3 次采購完，采購回的原料放置于冷庫密封貯藏待用。

無碘食鹽 市購；MRS培養基、PDA培養基、PCA培養基 北京陸橋技術股份有限公司；其他均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

GCMS-QP2010 GC-MS聯用儀 日本島津儀器公司； DB-WAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國 安捷倫公司；15 mL頂空進樣瓶、固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）裝置、50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭 美國Supelco公司； HD-3A智能水分活度檢測量儀 無錫市華科儀器儀表有限公司；JN-400i無菌均質器 寧波江南儀器廠；雷磁PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鹽漬菜制作及取樣

根據傳統鹽漬蘿卜的工藝[1]和預實驗的優化，本實驗濕態鹽漬蘿卜（S）設計如下：將蘿卜洗干凈，切分成長寬高為2～4 cm的塊狀，按菜和滅菌鹽水質量比1∶1裝入玻璃鹽漬菜壇，平衡后鹽度為3%，鹽漬蘿卜水分活度控制在0.95，壇沿加水密封發酵，每壇菜水總質量1 kg，裝滿至壇沿口處。半干態鹽漬蘿卜（B）：將蘿卜洗干凈晾干切成長為6～8 cm，寬為1 cm的條狀，曬干后用水清洗干凈后再擰干除去多余水分，裝壇發酵，平衡后鹽度為7%，水分活度控制在0.90，壓緊裝滿至壇沿處，加水密封，每壇菜總質量1 kg；干態鹽漬蘿卜（G）：制備同半干態，但水分活度控制在0.85。3 種工藝類型鹽漬蘿卜各制備10 壇，為避免鹽漬初期食鹽滲透不均勻等影響，鹽漬1 d后開始取樣分析，取發酵1、5、10、20、30 d的蘿卜固體進行分析；為了避免取樣對鹽漬蘿卜的影響，每次分析各取2 壇。

1.3.2 理化性質測定

水分活度：取粉碎混勻后的樣品約20 g，置于恒質量后的康氏皿中，置于水分活度測試儀器中進行測試，水分活度儀常溫下測定30 min至穩定后結束。

水分質量分數：參考GB/T 5009.3—2016《食品中水分的測定》中直接干燥法測定蘿卜水分。

pH值測定：參考GB/T 10468—1989《水果和蔬菜產品pH值的測定方法》，pH值用PHS-3C型pH計進行測定。

總酸測定：參考GB/T 12456—1990《食品中總酸的測定方法》中電位滴定法，用0.05 mol/L鹽酸標準滴定溶液反滴定至pH值為8.2，總酸含量以乳酸計。

1.3.3 微生物數量變化

取25 g蘿卜固體加入到225 mL含0.85% NaCl無菌生理鹽水的均質袋中，用拍擊式均質器拍打2 min，勻漿后進行1∶10梯度稀釋，選取合適的稀釋度和培養基，將0.5 mL稀釋液采用傾注法分別分析乳酸菌數量、細菌總數和真菌總數。乳酸菌和細菌分別在MRS、PCA培養基中于37 ℃培養48 h，真菌在PDA培養基中于30 ℃培養48～72 h，菌落數在30～300之間的平板記錄菌落數。平行重復3 次，取其平均值，以未接菌株的培養基作為空白對照。

1.3.4 揮發性成分分析

樣品處理和檢測條件：樣品的前處理參照Choi等[12]的方法略改，取組織搗碎后的樣品2.0 g，2.5 g NaCl，5 μL內標（4-甲基-2-戊醇甲醇溶液，質量濃度為0.4 μg/mL） 于15 mL頂空進樣瓶中，混勻密封置于40 ℃恒溫槽中水浴加熱平衡30 min，將老化后的SPME萃取頭插入到頂空進樣瓶中吸附30 min，然后拔出萃取頭插入到GC-MS進樣口，250 ℃解吸5 min，每個樣品獨立測定2 次。

GC條件：不分流進樣模式；進樣溫度40 ℃；進樣口溫度250 ℃；總流量50 mL/min；進樣時間1 min；控制流量方式：線速度；載氣為He；載氣流量1.2 mL/min。 程序升溫參考文獻[13]和[9]的方法并作優化。程序升溫：40 ℃，保持0 min；以16 ℃/min升溫到75 ℃，保持0 min；以2 ℃/min升溫到94 ℃（保持1 min），以 2 ℃/min升溫到110℃，保持1 min；以3 ℃/min升溫到122 ℃，保持1 min；以2 ℃/min升溫到130 ℃，保持1 min；以2 ℃/min升溫到136 ℃，保持1 min；以2 ℃/min升溫到143 ℃，保持1 min；以6 ℃/min升溫到200 ℃，保持5 min。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；檢測器電壓0.1 kV；Scan采集方式；質量掃描范圍35.00～350.00 u。

定性和定量分析：由GC-MS得到的色譜圖，經計算機在標準譜庫NIST 11和Wiley中比對檢索，選取相似度大于80（最大值為100）的物質進行定性分析，并準確地鑒定出各樣品的揮發性成分，同時采用4-甲基-2-戊醇的甲醇溶液（0.4 μg/mL）為內標進行半定量分析[14]，得到各組分的質量濃度。

1.3.5 多元統計分析

離子流圖、微生物計數和理化性質的結果使用Origin Pro 9.1進行處理與分析。揮發性成分導入SPSS 22.0軟件中進行極值法標準化處理，然后在SIMCA 14.1中進行層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）[15]。HCA按照樣本數大小分類，使用離差平方和算法。PCA圖中橢圓為Hotelling的T2區域，表示建模變異的95%置信區間。PCA模型的質量由R2（數據的方差）和Q2值（模型的預測）表示，PLS-DA模型進行200 次迭代置換測試以避免模型過度擬合，將分析變量重要性得分值大于1.2且t檢驗（P＜0.05）作為特征揮發性成分。

2 結果與分析

2.1 3 種鹽漬菜發酵過程中的微生物數量和理化特性變化

如圖1a、b所示，3 種發酵方式鹽漬蘿卜水分活度：濕態鹽漬蘿卜＞半干態鹽漬蘿卜＞干態鹽漬蘿卜。水分含量：濕態鹽漬蘿卜＞半干態鹽漬蘿卜＞干態鹽漬蘿卜。其中濕態鹽漬蘿卜發酵過程中水分活度維持在 0.96左右，水分質量分數維持在91%左右；半干態鹽漬蘿卜水分活度介于0.88～0.92之間，水分質量分數維持在71%～77%之間；干態鹽漬蘿卜水分活度介于0.84～0.87之間，水分質量分數維持在63%附近。3 種鹽漬蘿卜的水分活度和水分含量總體都保持穩定趨勢，差異明顯。根據Beuchat[16]有關水分活度對微生物生長的影響，結合鹽漬蘿卜水分分布，可知大多數細菌可以在濕態和半干態鹽漬蘿卜上生長，而對干態鹽漬蘿卜影響不大，說明水分的差異會對3 種鹽漬蘿卜發酵程度產生一定影響。

圖 1 不同發酵方式鹽漬蘿卜微生物數量和理化特性變化Fig. 1 Changes in microbial quantity and physicochemical properties of salted radish during fermentation

pH值和酸度顯示鹽漬蘿卜品質，而且還顯示鹽漬蘿卜中乳酸菌的生長情況[17-18]。如圖1c所示，隨著發酵的進行，鹽漬蘿卜pH值都呈下降趨勢，但濕態鹽漬蘿卜pH值下降速度較快。發酵5 d后濕態鹽漬蘿卜的pH值變化平緩，而半干態和干態鹽漬蘿卜整個階段pH值都大于4.5，表明半干態和干態鹽漬蘿卜發酵過程中產酸較弱。濕態工藝發酵初期總酸（以乳酸計）含量快速升高，發酵到第10天， 達到峰值4.5%，半干態和干態鹽漬蘿卜總酸含量呈現緩慢上升至穩定的趨勢，但遠高于濕態鹽漬蘿卜的總酸，這是由于原料中的有機酸在脫水過程中出現富集。

鹽漬蘿卜發酵過程中伴隨著微生物演替和數量變化，發酵初期附著在蘿卜表面的微生物利用蘿卜原料中的營養物質迅速繁殖。如圖1d所示，發酵過程中濕態鹽漬蘿卜的細菌數量呈現先上升后下降的趨勢，在第5天達到峰值，而半干態和干態鹽漬蘿卜呈逐漸下降趨勢。結合圖1e，乳酸菌數量變化趨勢和數量級同細菌相同，表明鹽漬蘿卜發酵過程中的細菌主要是以乳酸菌為主，該結論和相關文獻[19-22]研究結果相一致。如圖1f所示，3 種鹽漬蘿卜真菌數量都呈下降的趨勢，且初期真菌數量級遠低于細菌，表明鹽漬蘿卜中微生物主要以細菌為主導，真菌影響較小。

綜上所述，濕態鹽漬蘿卜屬于乳酸菌主導發酵的蔬菜制品，發酵程度高，產酸快，而半干態和干態鹽漬蘿卜整個過程微生物數量較低，發酵程度弱或不發酵。

2.2 3 種鹽漬蘿卜發酵過程中的揮發性成分

基于GC-MS途徑分析3 種發酵方式下鹽漬蘿卜的揮發性風味物質，如圖2所示。3 種鹽漬蘿卜離子強度大的物質出峰時間類似，但強度差異較大，表明有共同揮發性物質，但含量存在差異。濕態鹽漬蘿卜在15 min附近的離子強度隨著發酵進行先增強后減弱；半干態鹽漬蘿卜在20 min附近的離子強度隨著發酵進行先逐漸增強后減弱，而干態工藝是逐漸增強。說明3 種鹽漬蘿卜初始風味物質有共性和個性，隨著發酵的進行，部分風味物質逐漸累積或被轉換。

表 1 不同發酵方式鹽漬蘿卜發酵過程中揮發性風味成分Table 1 Contents of volatile flavor components in salted radishes fermented for different days

續表1

圖 2 不同發酵方式鹽漬蘿卜總離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatograms of volatile components from salted radishes fermented for different days

通過GC-MS分析3 種鹽漬蘿卜發酵30 d共得到揮發性風味物質61 種，其中濕態工藝鹽漬蘿卜26 種，半干態鹽漬蘿卜30 種，干態鹽漬蘿卜46 種，結果如表1所示。這些揮發性成分中包括醇類（17 種）、含硫化合物（6 種）、醛類（10 種）、酮類（8 種）、酸類（6 種）、酯類（2 種）和其他類化合物（12 種）。濕態發酵鹽漬蘿卜主要為含硫化合物、醇類、醛類和酸類，主要包含異辛醇、二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、乙酸和正己醛；半干態發酵主要為含硫化合物、醇類和醛類，主要包括異辛醇、順-2-戊烯醇、二甲基二硫醚、二甲基三硫醚和正己醛；干態發酵主要為含硫化合物、醇類、醛類和酮類，主要包括己醇、4-異硫代氰酸甲基戊酯、二甲基三硫醚、二甲基二硫醚、壬醛、3-羥基-2-丁酮。

2.3 3 種發酵方式的鹽漬蘿卜揮發性風味組分PCA

圖 3 基于PCA解析不同發酵方式鹽漬蘿卜揮發性風味組分Fig. 3 PCA analysis of volatile flavor components of three salted radishes

為反應3 種鹽漬蘿卜揮發性風味差異和組間樣本差異，采用PCA無監督的多元變量統計分析。篩選在3 個樣品以上都含有的46 種風味成分進行PCA，3 種鹽漬蘿卜特征變量62.1%的累計差異被描述，包含39.8%的PC1和22.3%的PC2，結果如圖3A所示。同一95%置信區域顯示3 種鹽漬蘿卜得到明顯的區分。根據發酵周期，濕態鹽漬蘿卜樣品點處于第3象限，隨著發酵進行，樣品點逐漸移動；半干態鹽漬蘿卜處于第1象限和第2象限，其中發酵10 d樣品差異較大，可能發酵過程中受到污染，風味異常；干態鹽漬蘿卜處于第4象限，各發酵階段樣品之間差異明顯，這與干態樣品干基質量，風味物質含量高有關。同時結合圖1a、c可知，3 種鹽漬蘿卜初始風味差異大，半干態和干態鹽漬蘿卜風味主要發生氧化、分解等理化過程，而濕態鹽漬蘿卜發酵產酸，其風味產生有理化和微生物等作用。

3 種發酵方式的鹽漬蘿卜風味物質由篩選的46 種降維到2 個不相關的主成分，以46 種風味物質的PC1載荷值為橫坐標，PC2的載荷值為縱坐標，結果如圖3B所示。PC1中正影響揮發性物質載荷系數達到0.8以上有11 種，4-異硫代氰酸甲基戊酯（0.934）、己醇（0.928）、癸醛（0.913）、壬醛（0.907）、二甲基四硫醚（0.850）、 3-羥基-2-丁酮（0.837）、1-辛烯-3-醇（0.834）、1-異硫代氰酸己酯（0.827）、3,5-辛二烯-3-酮（0.816）、4-仲丁基苯酚（0.805）和1-庚醇（0.805），這些成分與PC1有高度相關性，是PC1中正影響揮發性物質的典型代表。PC2中正影響揮發性物質載荷系數達到0.8以上只有順-2-戊烯醇（0.869）與PC2有高度相關性，PC1和PC2上的負影響揮發性物質載荷系數都小于0.8，表明與主成分相關性不高。

2.4 不同發酵方式鹽漬蘿卜特征揮發性成分

圖 4 不同發酵方式鹽漬蘿卜揮發性成分PLS-DA及特征性成分Fig. 4 PLS-DA analysis of volatile components and identification of characteristic components of three salted radishes

為了將3 種鹽漬蘿卜在風味上最大化分離，采用監督模式識別方法PLS-DA。如圖4A所示，模型解釋率R2X、RY2和模型預測能力Q2值分別為0.685、0.949和0.826，其中R2Y和Q2都大于0.5，說明模型質量較好[23]。根據PCA模型顯示3 種鹽漬蘿卜在95%置信區域內得到了明顯的區分。同時采用HCA模型，如圖4B所示，根據樣本點間的距離可以將濕態、半干態和干態鹽漬蘿卜各分為一類。隨著發酵進行，區分越明顯，說明3 種鹽漬蘿卜的揮發性風味具有顯著差異。

PLS-DA模型經過200 次置換測試進行驗證，發現Q2和R2值高于其原始值（最右側大于左側），證明該模型的適用性和有效性[24]，如圖4C所示。為了確定3 種鹽漬蘿卜的特征性風味成分，篩選出重要度（＞1.2）以及t檢驗（P＜0.05）的差異代謝物12 種，按照重要度從大到小分別為1-戊烯-3-醇、順-2-戊烯醇、己酸、1,1-二(甲硫基)乙烷、二甲基三硫醚、乙酸、3-羥基-2-丁酮、2-正戊基呋喃、二甲基四硫醚、庚醛、苯乙醇和甲氧基苯肟。

如圖4D所示，12 種成分進行聚類分析分為3 類，結果同圖4B，說明12 種風味成分為3 種鹽漬蘿卜的特征性物質。其中乙酸主要為濕態鹽漬蘿卜特征性成分，發酵5 d后出現，是鹽漬蘿卜中常見的揮發性有機酸，其風味刺激，適量的乙酸對鹽漬蘿卜風味具有提升作用[25]。乙酸主要為鹽漬蘿卜發酵前期出現的醋酸菌和異型乳酸菌等微生物代謝產生[26]，也有報道大腸桿菌等分解葡萄糖產生乙酸[27]，這與大量報道鹽漬蘿卜發酵前期出現豐度較高的腸桿菌科細菌相一致[28-29]。發酵后期不耐酸的微生物消失，乙酸含量出現穩定或下降，可能與醇類物質發生酯化反應生成乙酸乙酯或其他轉化。

1-戊烯-3-醇、順-2-戊烯醇、1,1-二(甲硫基)乙烷和甲氧基苯肟為半干態鹽漬蘿卜特征性成分，其中1-戊烯-3-醇具有水果香味和陳氣味[30]。甲氧基苯肟在濕態鹽漬蘿卜中也有少量檢出，在其他植物、羅非魚中常被檢 測出[31-33]，該物質可能為原料自身攜帶，易受到環境影響而轉化。

己酸、二甲基三硫醚、3-羥基-2-丁酮、2-正戊基呋喃、二甲基四硫醚、庚醛和苯乙醇為干態鹽漬蘿卜特征性成分。己酸是己酸菌的代謝產物，常在厭氧發酵 產生[34]，這與鹽漬蘿卜發酵環境一致。同時，也有報道脂質氧化產生的小分子醛類物質[35]，在干態鹽漬蘿卜中可能來源于原料長時晾曬脫水發生氧化。二甲基三硫醚在3 種鹽漬蘿卜中都大量發現，在濕態鹽漬蘿卜中隨著發酵進行逐漸減少，在半干態和干態鹽漬蘿卜中經過脫水含量較高，該物質常被報道是四川鹽漬菜[36-37]、韓國泡菜[7-8]等主要風味物質，其閾值低，呈蔥香味[36]。2-正戊基呋喃具有烘烤香，其在干制植物如干黃芪[38]、干制綠茶[30]等中大量發現，說明該物質為干態鹽漬蘿卜制作過程中產生的風味成分。苯乙醇在天然植物中發現，具有果香、玫瑰花香[39]。庚醛呈強烈和不愉快脂肪氣味，是干制魚類中的特征性風味成分[40]。3-羥基-2-丁酮具有強烈的奶油味香氣[41]。二甲基四硫醚常被報道為干制香菇和蔬菜原料含硫物質分解成分[42-43]，結合圖1a、c、e可知，干態鹽漬蘿卜的特征性風味成分主要為原料在經過氧化、干燥脫水等過程中形成的風味成分，該類物質往往閾值低，呈味明顯。結果與其他研究學者有相同也有差異，這主要是揮發性風味物質還與原輔料、溫度、鹽度和檢測條件等因素有關，研究結果難以相互比較。本實驗鹽漬蘿卜采用理想的狀態（恒溫、不含香辛料）進行分析，可以從風味的角度區分鹽漬蘿卜的發酵程度和發酵方式。但現實的鹽漬蘿卜往往是一個復雜的環境，要進一步研究鹽漬蘿卜風味產生機理、環境因子影響等，才更有利于鹽漬蘿卜風味物質的調控。

3 結 論

本研究以不同發酵方式鹽漬蘿卜為研究對象，從發酵過程中的微生物數量變化和理化特性分析3 種鹽漬蘿卜的品質及發酵特性，表明了濕態鹽漬蘿卜更有利于乳酸菌越快生長，發酵產酸快，而半干態和干態鹽漬蘿卜微生物影響較小，其發酵弱或不發酵。基于GC-MS途徑定量分析出濕態、半干態和干態鹽漬蘿風味物質61 種，結合PCA、HCA和PLS-DA，揭示了 3 種鹽漬蘿卜發酵過程中的重要影響成分和特征揮發性成分，從風味角度區分3 種發酵方式鹽漬蘿卜的工藝特性和發酵狀態。然而，鹽漬蘿卜需更詳細的研究水分活度、氧氣、鹽度等環境因子對鹽漬蘿卜感官特征、微生物群落和揮發性風味物質的相互關系，能為鹽漬蘿卜風味的定向調控提供理論依據。