副干酪乳桿菌SMN-LBK在乙醇 脅迫下的轉錄組分析

郭金鳳，楊 婕，李寶坤，金 丹，黎 旭，盧士玲，王慶玲，姬 華，董 娟，李應彪，蔣彩虹

（石河子大學食品學院，新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，新疆 石河子 832003）

副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）是一種兼性厭氧、不運動、不產(chǎn)芽孢、發(fā)酵葡萄糖主要產(chǎn)生L-乳酸的桿狀或長桿狀革蘭氏陽性菌[1]。副干酪乳桿菌能促進人體內微生物菌群的平衡以及酶的平衡[2]，同時還可以刺激特異性和非特異性的免疫機制，具有預防某些疾病、促進發(fā)育、增強體質、延緩衰老和延長壽命的益生功效[3]，是近年來國外研究頗多的益生乳酸細菌。

副干酪乳桿菌廣泛存在于馬奶酒等傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品及腸道中，還有少量存在于一些低度清酒[4]和白蘭地中[5]。因此，副干酪乳桿菌易遭受乙醇脅迫。研究表明，在乙醇脅迫下細胞膜首先受到攻擊，乳酸菌通過改變不飽和脂肪酸的比例[6]，提高細胞膜的流動性[7]，造成胞內物質流失，致使正常生理功能及代謝調控失常。因此，提高菌株的乙醇適應能力對其在食品工業(yè)的應用具有重要作用。

近年來，隨著分子生物技術、轉錄組學及生物信息學的發(fā)展，在脅迫研究方面，科研人員正在通過轉錄組學，進行乳酸菌在不同因素脅迫后差異基因的分析，進而研究乳酸菌的脅迫機制。因此，轉錄組學是研究生物耐受機制的重要手段。目前雖有關于乙醇耐受性的報道，但是對乳酸菌的乙醇脅迫應答機制卻缺乏了解。本研究以1 株分離于新疆塔城地區(qū)馬奶酒中的耐乙醇菌株副干酪乳桿菌SMN-LBK為研究對象，分別以4%、6%、8%、10%乙醇進行脅迫處理，測定其存活率，并以10%乙醇為對其進行脅迫處理，對其基因表達情況進行研究，旨在從轉錄水平上揭示副干酪乳桿菌SMN-LBK的乙醇脅迫應答機制，并為進一步闡明乳酸桿菌的耐受機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

副干酪乳桿菌SMN-LBK是從新疆塔城地區(qū)馬奶酒樣品中分離篩選出的1 株耐乙醇乳酸菌。

液體MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母浸粉5 g、無水乙酸鈉5 g、葡萄糖20 g、檸檬酸三銨2 g、磷酸氫二鉀2 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、 吐溫80 1 mL，蒸餾水1 000 mL，調節(jié)pH 6.2～6.4，121 ℃滅菌20 min。

固體MRS培養(yǎng)基：在液體MRS培養(yǎng)基內添加18 g/L瓊脂粉，于121 ℃滅菌20 min。

含乙醇MRS培養(yǎng)基：已滅菌液體MRS培養(yǎng)基按不同體積比添加無水乙醇，配制成4%、6%、8%、10%（體積分數(shù)）乙醇培養(yǎng)基，以不添加乙醇的培養(yǎng)基作為對照。

1.1.2 試劑

焦炭酸二乙酯 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；TaKaRa逆轉錄試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；UltraSYBR Mixture 康為世紀生物科技有限公司；Trizol試劑、Qubit?RNA檢測試劑盒 美國Life公司；RNA Nano 6000檢測試劑盒 美國安捷倫公司；NEBNext?Ultra? Directional RNA Library Prep Kit for Illumina?美國NEB公司；瓊脂糖 北京天根生物科技有限公司；異丙醇、三氯甲烷、無水乙醇 天津市福晨化學試劑有限公司；其余均為分析純。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1CU雙人單面超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設備有限公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；Centrifuge 5417R高速冷凍 離心機 德國Eppendorf公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；ND2000C微量核酸蛋白分析儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；GeI Doc XR+ 凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；MX3000P實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR）分析儀、2100生物分析儀 美國Agilent公司；HiSeq2500測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

取-80 ℃甘油貯存液以2%接種量接種于5 mL已滅菌MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，獲得活化種子液。以2%接種量接種種子液于5 mL已滅菌的液體MRS培養(yǎng)基中，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，獲得活化菌株。

1.3.2 乙醇脅迫

如圖1所示，S10為空白對照，SP10為10%乙醇脅迫處理。將活化副干酪乳桿菌SMN-LBK以2%接種于已滅菌的液體MRS培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)至OD600nm為0.8，吸取2%上述菌液分別接種至不含乙醇MRS培養(yǎng)基及含4%、6%、8%、10%乙醇MRS培養(yǎng)基內，37 ℃培養(yǎng)3 h。

圖 1 乙醇脅迫處理示意圖Fig. 1 Schematic illustration of ethanol stress treatment

1.3.3 存活率測定

將經(jīng)過乙醇脅迫處理的菌液以無菌0.85%生理鹽水清洗2 次，并同體積進行重懸，吸取1 mL重懸菌液于無菌0.85%生理鹽水中梯度稀釋，于固體MRS培養(yǎng)基上涂布，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，測定存活率，實驗重復3 次，每次3 個平行樣品。存活率計算公式如下：

式中：Nc為未經(jīng)乙醇脅迫活菌數(shù)；Ns為乙醇脅迫后活菌數(shù)。

1.3.4 轉錄組測序

采用焦炭酸二乙酯處理所有實驗相關耗材，按照Trizol試劑說明書提取菌株總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度以及是否有污染；采用Nanodrop檢測RNA的純度（OD260nm/OD280nm）；按照Qubit?RNA檢測試劑盒說明書對RNA濃度進行精確定量；通過Agilent 2100生物分析儀精確檢測RNA的完整性。運用NEBNext?Ultra? Directional RNA Library Prep Kit for Illumina?進行文庫構建，并用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物。采用Qubit 2.0進行初步定量，稀釋文庫至1 ng/μL后，采用2100生物分析儀對文庫的插入片段長度進行檢測。將合格的不同文庫按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量的需求pooling后進行HiSeq 2500測序。

1.3.5 real-time PCR對轉錄組結果驗證

按照TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書合成第1鏈cDNA，real-time PCR所用的引物見表1，其中16S rRNA作為內參基因，采用ddH2O作為陰性對照。按照UltraSYBR Mixture說明書進行real-time PCR。real-time PCR體系（20 μL）：熒光染料混合液10 μL、正向引物0.4 μL、反向引物0.4 μL、cDNA模板0.8 μL、用ddH2O補足至20 μL。real-time PCR程序：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸32 s，循環(huán)40 次；溶解曲線分析：95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，95 ℃熒光信號采集15 s，60 ℃冷卻15 s。每個樣品設置3 次平行。利用2-ΔΔCt法分析基因的相對表達量，使用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學差異的顯著性分析。

表 1 real-time PCR引物Table 1 Sequences of primers used for real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 質量控制

測序得到的原始測序序列，對raw reads進行過濾，去除帶接頭的、低質量的reads，得到clean reads，后續(xù)分析都基于clean reads，同時計算clean reads的GC含量（堿基G和C數(shù)量總和占總堿基數(shù)量的百分比）、Q20、Q30含量（Phred數(shù)值大于20、30的堿基占總體堿基百分比）。

1.4.2 基因表達水平分析

采用HTSeq軟件對各樣品進行基因表達水平分析[8]， 根據(jù)基因的長度計算每百萬片段中來自某一基因每千堿基長度的片段（fragments per kilobase per million，F(xiàn)PKM）數(shù)目[9]。本研究以FPKM=1作為判斷基因是否表達的閾值標準[10]。

1.4.3 差異基因表達分析

使用DESeq R軟件包（1.18.0）進行兩組的差異表達分析，基于負二項式分布的模型確定數(shù)字基因表達數(shù)據(jù)中的差異表達。使用Chen Rongjun等[11]方法調整所 得P 值以控制錯誤發(fā)現(xiàn)率。通過D E S e q 發(fā)現(xiàn)調整的P ＜0.0 5 的基因為差異基因。對檢測結果以 log2|Fold Change|＞1、P＜0.05作為標準進行篩選，對差異基因表達情況進行具體分析。

1.4.4 差異基因功能富集分析

采用GOSeq R軟件包對差異基因進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析，其中對基因長度偏差進行校正，具有校正的P＜0.05的GO term是顯著富集的差異基因。京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）是一個數(shù)據(jù)庫資源，用于從基因組測序產(chǎn)生的大規(guī)模分子數(shù)據(jù)集和其他高通量數(shù)據(jù)庫中了解生物系統(tǒng)的高級功能和效用（http://www.genome.jp/kegg/）。采用KOBAS軟件測試KEGG途徑中差異基因的富集[12]。

2 結果與分析

2.1 乙醇脅迫對副干酪乳桿菌SMN-LBK存活率的影響

圖 2 不同體積分數(shù)乙醇脅迫下副干酪乳桿菌SMN-LBK的存活率Fig. 2 Survival rates of L. paracasei SMN-LBK under ethanol stress at different concentrations

由圖2可知，以乙醇體積分數(shù)0%作為對照組，以4%、6%、8%、10%乙醇對副干酪乳桿菌的SMN-LBK進行脅迫處理，其存活率依次為25.84%、18.39%、10.86%、1.67%，副干酪乳桿菌SMN-LBK的最高耐乙醇脅迫能力為10%。

2.2 測序數(shù)據(jù)質量分析

表 2 數(shù)據(jù)質量分析 Table 2 Quality analysis of transcriptomic sequencing data

由表2可知，兩組處理的Q20值均大于95%，Q30值均大于88%，GC含量均在50%左右。結果表明轉錄組測序數(shù)據(jù)質量好，準確性高。

2.3 基因表達水平分析

表 3 不同表達水平區(qū)間的基因數(shù)量Table 3 Statistics of expression levels of differentially expressed genes

由表3可知，兩組處理的基因表達量均在PFKM 1～3區(qū)間最低，每個基因的表達水平在3.07%～3.95%范圍內；基因表達量均在FPKM＞60區(qū)間最高，每個基因的表達水平在47.02%～50.55%范圍內，說明多數(shù)基因以高水平表達。

2.4 差異基因表達分析

2.4.1 差異基因篩選

圖 3 差異基因上下調情況Fig. 3 Statistics of up-regulated and down-regulated genes

由圖3可知，在SP10與S10組內上調表達差異基因524 個，下調表達差異基因550 個；上調表達顯著差異基因28 個，下調表達顯著差異基因50 個（log2|Fold Change|＞1，P＜0.05）。

圖 4 乙醇不同處理下差異基因聚類分析Fig. 4 Clustering analysis of differentially expressed genes under ethanol stress at different concentrations

2.4.2 差異基因表達聚類分析

采用差異基因火山圖推斷其整體分布情況，聚類分析判斷差異基因在乙醇脅迫的表達模式。聚類分析以差異基因表達變化1 倍以上且錯誤發(fā)現(xiàn)率小于0.05進行繪制。由圖4可知，有4 類表達模式相同或相近的基因聚集成類，它們可能具有相似的功能或參與相同的生物學過程。

2.4.3 real-time PCR驗證分析

圖 5 real-time PCR驗證轉錄組測序Fig. 5 Real-time PCR validation of transcriptomic sequencing data

對差異顯著的基因進行real-time PCR驗證，如圖5所示，real-time PCR結果與轉錄組結果具有一致性。因此，充分驗證了轉錄組數(shù)據(jù)的正確性與可靠性。

2.5 差異基因功能富集分析

圖 6 乙醇不同處理下差異基因GO富集分析Fig. 6 GO enrichment analysis of differentially expressed genes under ethanol stress at different concentrations

GO富集分析以閾值（P＜0.05）為依據(jù)評價差異基因的主要生物學功能，其主要包括細胞組分（cellcular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物過程（biological process，BP）三類。由圖6 可知，SP10與S10相比，BP組蛋白代謝過程、細胞內蛋白代謝過程、翻譯過程為顯著富集GO term；CC組核糖體、核糖核蛋白復合物為顯著富集GO term；MF組核糖體的結構成分、金屬離子跨膜轉運蛋白活性為顯著富集GO term。KEGG是一個綜合數(shù)據(jù)庫，整合了基因組信息、化學信息和生化系統(tǒng)功能信息。KEGG Orthology（KO）是KEGG直系同源數(shù)據(jù)庫，將各個KEGG注釋系統(tǒng)聯(lián)系在一起，將分子網(wǎng)絡和基因組信息聯(lián)系起來，根據(jù)直系同源關系，實現(xiàn)跨物種的基因組或轉錄組的功能注釋。結合KEGG數(shù)據(jù)庫對差異顯著基因參與的相關代謝通路進行了分析，由表4可知，差異顯著基因主要參與了丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、脂肪酸生物合成、ATP結合盒式蛋白（ATP-bindingcassette，ABC）轉運體、磷酸轉移酶系統(tǒng)（phosphotransferase system，PTS）。

表 4 乙醇脅迫下差異顯著基因Table 4 Genes that showed significantly different expression levels under ethanol stress

2.5.1 乙醇對參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝的基因表達情況的影響

由表4可知，pyrB SP10相對S10顯著上調。ald1顯著下調表達，dltA、dltB、dltC SP10相對S10均顯著上調。PyrB是包括大腸桿菌在內的所有原核生物嘧啶核苷酸從頭合成中很重要的一個限速酶，它催化的是天冬氨酸與氨甲酰磷酸生成氨甲酰天冬氨酸和無機磷的反應[13]。Gerhart等[14]發(fā)現(xiàn)PyrB的一個最有效抑制劑是代謝途徑的終產(chǎn)物胞嘧啶三磷酸（cytosine triphosphate，CTP），當CTP水平高時，CTP與PyrB結合，降低CTP合成的速度，反之當細胞內CTP水平低時，CTP從PyrB上解離，加快CTP合成速度，研究還發(fā)現(xiàn)ATP是酶的別構激活劑。本研究發(fā)現(xiàn)pyrB顯著上調，這說明副干酪乳桿菌SMN-LBK在乙醇脅迫下，pyrB被激活，天冬氨酸轉氨甲酰酶催化天冬氨酸與氨甲酰磷酸生成氨甲酰天冬氨酸和無機磷，此時細胞內CTP水平低，加速了pyrB作用，這也是副干酪乳桿菌自我保護的一種方式。

趙鵬[15]研究表明ald基因在氧化脅迫情況下顯著下調表達，胞內丙氨酸的代謝受到影響。Ald是一種雙向反應酶，正向以丙氨酸為底物氧化脫氨生成丙酮酸、NADH，并釋放NH3[16]。逆向由丙酮酸氨化生成丙氨酸，消耗一分子銨和NADH[17]。本研究ald1 SP10相對S10顯著下調表達，說明副干酪乳桿菌SMN-LBK在乙醇脅迫下，Ald催化丙酮酸生成丙氨酸的活性降低，而丙氨酸廣泛存在于已知蛋白中，此外，它還在組成細胞壁肽聚糖骨架具有重要作用，所以ald可能參與并調控了副干酪乳桿菌S10的乙醇脅迫調控，并且在其細胞質的蛋白質以及細胞壁生物合成中受到了抑制。DltB是革蘭氏陽性細菌的一種dlt操縱子，其催化D-丙氨酸殘基并入脂磷壁酸中[18]。 脂磷壁酸是一種革蘭氏陽性（G+）菌細胞壁特殊組分，由核糖醇或甘油殘基經(jīng)由磷酸二鍵互相連接而成的多聚物，其可以跨過肽聚糖層，以其末端磷酸共價連接于質膜中糖脂（例如二葡糖基二酰基甘油）的寡糖基部分。本研究發(fā)現(xiàn)dltA、dltB和dltC SP10相對S10均顯著上調，說明副干酪乳桿菌SMN-LBK通過增強與細胞壁合成相關基因的表達抵抗乙醇的侵害。

2.5.2 乙醇對參與脂肪酸生物合成基因表達情況的影響

由表4可知，fabG和fabZ基因SP10相對S10顯著下調表達。fabG催化細菌脂肪酸合成途徑中催化3-氧酰基-ACP還原為3-羥酰基-ACP[19]，消耗NADPH或NADH，是必需的還原步驟[20]。Filip’echev等[21]研究表明，用于假定fabG質粒AZOBR_p1-攜帶的fabG基因，對于在Azospirillum brasilenseSp245中雙鞭毛系統(tǒng)的正確裝配和工作是必需的。Putim等[22]基于STITCH數(shù)據(jù)庫的分析預測fabG與結核分枝桿菌抗藥性有關。Tan等[23]研究發(fā)現(xiàn)增加fabZ的用量可使大腸桿菌辛酸效價的最高增加45%。Kastaniotis等[24]發(fā)現(xiàn)YHR067w編碼一種新的線粒體fabZ，線粒體FAS途徑的功能與硫辛酸或磷脂生物合成、蛋白質膜插入或內膜氧化損傷修復相關。本研究中fabG和fabZ SP10相對S10顯著下調表達，說明在乙醇脅迫下，副干酪乳桿菌SMN-LBK的脂肪酸合成受阻，細胞膜內膜受損，從而對乙醇的抵抗能力下降。

2.5.3 乙醇對ABC轉運體基因表達情況的影響

由表4可知，gbuB、gbuA、macB2、肽ABC轉運蛋白底物結合蛋白基因、mppA、ykpA、yclF和rbsA SP10相對S10均顯著下調表達。ABC轉運系統(tǒng)是一個與結構相關的吸收和外運系統(tǒng)的超家族[25]。ABC轉運蛋白通常由多個亞基組成，其中1 個或2 個是跨膜蛋白，還有膜相關ATPase。ATPase亞基利用ATP結合和水解的能量促進各種底物跨膜轉運，以吸收或輸出底物。肽ABC轉運蛋白底物結合蛋白基因、mppA、yclF都是與肽轉運蛋白相關的基因，細胞膜上的肽轉運蛋白不僅能夠轉運小肽進入細胞提供營養(yǎng)，并且還參與了信號轉導、趨化性等重要生理活動[26]。王艷紅等[27]從中度嗜鹽菌喜鹽芽孢桿菌Halobacillus Y5中成功克隆了1 個新的耐鹽堿基因（HY5_opu D），該基因是1 個新的甘氨酸甜菜堿轉運蛋白基因，能夠使大腸桿菌KNabc在0.2 mol/L NaCl、5 mmol/L LiCl及堿性（pH 8.0）環(huán)境下生長。Park等[28]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌高親和力核糖轉運蛋白由周質核糖結合蛋白（RBP或RbsB）、膜組分（RbsC）和ATP結合蛋白（RbsA）組成。本研究發(fā)現(xiàn)SP10相對S10下副干酪乳桿菌SMNLBK 8 個基因均顯著下調表達。在乙醇作用下，細菌的細胞膜通透性增大，使跨膜蛋白肽健斷裂，與膜相關ATPase活性受到抑制，使其正常的跨膜運動與物質運輸遭受破壞。

2.5.4 乙醇對參與PTS的基因表達情況的影響

由表4可知，fruA、MtlA、agaW SP10相對S10均顯著下調。糖PTS是許多乳酸桿菌中將外界碳源轉運進細胞并將其進行磷酸化的一種重要工具[29]。PTS通過涉及PTS的不同組分的一系列步驟將磷酸烯醇式丙酮酸酯的磷酸鹽基團轉移到進入的糖中發(fā)揮作用。PTS由缺乏糖特異性的細胞質組分和膜相關酶構成，其對少數(shù)糖具有特異性。細胞質組分是酶I（EI）和組氨酸可磷酸化蛋白（HPr）。PTS系統(tǒng)的膜成分酶II（EII）由3～4 個亞基組成：IIA、IIB、IIC和有時IID[30]。本研究表明：副干酪乳桿菌SMN-LBK在乙醇脅迫下，其對果糖、甘露糖、乙酰半乳糖胺的轉運能力下降，從而可能使其正常的碳代謝受到抑制而影響其代謝調控。

3 結 論

丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝基因（ald1）、脂肪酸生物合成基因（fabG、fabZ）、ABC轉運體（macB2、gbuB、gbuA、mppA、ykpA、yclF、rbsA、肽ABC轉運蛋白底物結合蛋白基因）、PTS（fruA、mtlA、agaW）在乙醇脅迫下顯著下調表達，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝基因（pyrB、dltA、dltB、dltC）在乙醇脅迫下顯著上調表達，這說明副干酪乳桿菌SMN-LBK脂肪酸合成代謝受到抑制，物質跨膜運輸受到抑制，而天冬氨酸和丙氨酸代謝相關基因與細胞壁主要成分肽聚糖、磷壁酸的生物合成相關，其可能通過提高這些基因表達抵御乙醇對自身的損害。副干酪乳桿菌面對高用量乙醇脅迫，其基因或者其編碼的蛋白正常的結構受到破壞，從而使其正常功能不能夠得以全部發(fā)揮，這些基因可能與副干酪乳桿菌SMN-LBK的乙醇脅迫機制密切相關，但其具體乙醇耐受機制還有待進一步研究。