嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的C末端 結構域功能及生淀粉結合位點分析

曾 靜，郭建軍，涂熠坤，袁 林,

（1.江西省科學院微生物研究所，江西 南昌 330096；2.南京工業大學化學與分子工程學院，江蘇 南京 211800）

生淀粉α-淀粉酶是指能對不經過蒸煮糊化的生淀粉顆粒表現出強水解活性的α-淀粉酶[1-4]。生淀粉α-淀粉酶可以在低于糊化溫度條件下直接作用于未經蒸煮糊化的生淀粉顆粒，在淀粉液化過程中能夠省去生淀粉糊化步驟，有利于節約能源和簡化工藝，因此生淀粉α-淀粉酶在釀造、食品、造紙、紡織等領域具有巨大的應用潛力。

生淀粉α-淀粉酶往往是多結構域蛋白質，除催化結構域，還包含一個不具有催化功能的淀粉結合結構域（starch binding domain，SBD），這是它能夠直接水解未經糊化處理的生淀粉顆粒的關鍵[5-8]。SBD屬于碳水化合物結合分子（carbohydrate-binding modules，CBM）[9-12]。 SBD作為生淀粉酶的天然部分主要可使淀粉酶分子可以在溶液中與不溶性底物（淀粉顆粒）結合，將底物運送到催化結構域的活性位點以及使淀粉顆粒表面破裂。SBD通常位于酶的N-末端或C-末端，微生物來源的生淀粉α-淀粉酶的SBD結構域一般位于其分子結構的C末端。SBD的蛋白質序列一般由90～130 個氨基酸殘基組成，通常在與催化結構域分離的情況下仍能發揮功能。SBD與生淀粉的結合主要依靠芳香族氨基酸（特別是Trp）與葡萄糖環的堆積作用。

來源于嗜熱菌Geobacillus thermoleovorans的嗜熱酸性α-淀粉酶Gt-amy屬于生淀粉α-淀粉酶，具有優良的高溫活性和熱穩定性，并且不依賴于Ca2+，可在淀粉液化工藝條件下有效酶解玉米淀粉[13]。因此Gt-amy在淀粉液化工藝具有巨大的應用潛力。Gt-amy的模擬分子結構顯示其由結構域A、B和C三個結構域組成。利用NCBI網站的保守結構域數據庫（Conserved Domain Database，CDD）對Gt-amy的保守結構域進行分析，結果顯示結構域C中C-末端結構域（C-terminal domain，CTD，Lys470～Phe549）屬于未知功能結構域[14]。 Gt-amy CTD由β片層結構組成，這符合B型CBM的結構 特征[15]。但是CTD的氨基酸序列與其他已知的CBM無序列相似性，因此無法通過序列分析推斷其功能。本研究通過對Gt-amy CTD進行缺失突變確定其在Gt-amy結合和降解生淀粉中的作用。在此基礎上，對CTD中色氨酸殘基Trp進行定點突變，通過比較CTD與突變體的生淀粉結合能力，確定CTD中參與生淀粉結合的氨基酸殘基。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）JM109、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）WB600、枯草芽孢桿菌表達載體pSTOP1622、Gt-amy表達載體pSTOP1622-gtamyhds均由本實驗室保存；K O D-P l u s-n e o D N A 聚合酶 日本Toyobo公司；DNA膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒E.Z.N.A. 美國Omega BioTek公司；DNA限制性內切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質Marker 美國Fermentase公司；Chelating SepharoseTMFast Flow 美國GE Healthcare公司；Bradford法蛋白濃度測定試劑盒、木糖、咪唑 生工生物工程（上海）股份有限公司；玉米淀粉 美國Sigma公司；試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Mastercycler gradient聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Eppendorf公司；SCIENTZ-IID超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；TY04S-3C凝膠成像系統 北京君意東方電泳設備有限公司；SP-752PC紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學分析

以來源于Bacillus stearothermophilus的α-淀粉酶BstA（PDB ID：1hvxA）的蛋白質分子結構為模板[16]，采用Swiss-Model（http://swissmodel.expasy.org）模建Gt-amy（Ala35～Phe516）的蛋白質分子結構[17]。采用NCBI的在線軟件BLASTP和CDD對蛋白序列進行相似性分析和結構域預測（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）。從CAZy（Carbohydrate-Active Enzyme）數據庫（http://www.cazy.org/Carbohydrate-Binding-Modules.html）中搜索獲得已知生淀粉酶的SBD序列[18]。采用ClustalX 2.0.8軟件對CTD及SBD序列進行序列比對，并采用MEGA 5.2建立系統進化樹。

1.3.2 重組質粒pSTOP1622-gtamy-Th和pSTOP1622-ctdh的構建及鑒定

以重組質粒pSTOP1622-gtamyhds為模板，采用引物P1和P2進行PCR擴增（表1），獲得編碼催化結構域的基因gtamy-Th。PCR擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，68 ℃延伸1 min，35 個循環；68 ℃延伸10 min。擴增產物經Bgl II和Sph I雙酶切，連接至經相同酶切處理的載體pSTOP1622，構建重組質粒pSTOP1622-gtamy-Th。以重組質粒pSTOP1622-gtamyhds為模板，采用引物P3和P4進行PCR擴增（表1），獲得編碼CTD的基因ctdh。重組質粒pSTOP1622-ctdh的構建方法同上。采用限制性內切酶Bgl II和Sph I共同處理重組質粒鑒定是否有外源基因的插入。

表 1 用于構建重組質粒的引物Table 1 Sequences of primers used for the construction of recombinant plasmids

1.3.3 CTD相關定點突變體的構建及鑒定

根據QuikChange?點突變試劑盒的原理，結合 α-淀粉酶Gt-amy基因gtamy和擬突變的氨基酸位點設計引物W471A-F、W471A-R、W501A-F、W501A-R、W514A-F、W514A-R、W526A-F、W526A-R、W533A-F、W533A-R、W540A-F、W540A-R、W548A-F、W548A-R（表1），構建CTD相關定點突變體W471A、W501A、W514A、W526A、W533A、W540A、W548A、W501A/W514A。以定點突變體W501A/W514A的構建為例，以重組質粒pSTOP1622-ctdh為模板，采用引物W501A-F和W501A-R，進行PCR擴增得到包含載體序列和基因序列的線性片段。PCR擴增條件與1.3.2節中PCR擴增條件相同。擴增產物經Dpn I酶處理后，轉化大腸桿菌JM109，將轉化子涂布于卡那霉素抗性平板，篩選轉化子，經測序鑒定是否為突變基因W501A。在此基礎上，以pSTOP1622-ctdhW501A為模板，采用引物W514A-F和W514A-R，進行PCR擴增，重復以上實驗步驟，獲得重組質粒pSTOP1622-ctdhW501A/W514A。將重組質粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，并與對應基因序列進行比對確認。

1.3.4 重組蛋白質的誘導表達和純化

將重組質粒分別轉化枯草芽孢桿菌WB600，獲得重組枯草芽孢桿菌并進行誘導表達。枯草芽孢桿菌WB600感受態細胞的制備和轉化采用改進的Spizizen法[19]進行。重組蛋白質的誘導表達和純化參照文獻[20]進行。

利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）檢測重組蛋白質，并采用Bradford法測定重組蛋白質含量[21]。

1.3.5 α-淀粉酶活力測定

將10 μL酶液與490 μL含1 g/100 mL可溶性淀粉的50 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid，MES）緩沖液（pH 5.0）混合，于80 ℃反應30 min后，迅速放入冰水浴中終止反應，然后采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[22]測定反應體系中還原糖量。酶活力定義：在一定反應條件下，每分鐘催化產生1 μmol還原糖的酶量為1 個酶活力單位（U）。

1.3.6 α-淀粉酶的動力學常數測定

用50 mmol/L MES緩沖液（pH 5.0）配制不同質量分數可溶性淀粉溶液或玉米淀粉溶液（0.1%、0.2%、0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%、5%），分別向可溶性淀粉溶液或玉米淀粉溶液中加入等量的酶液，按照1.3.5節方法測定酶活力。根據雙倒數作圖法，以底物濃度的倒數為橫坐標，以酶比活力的倒數為縱坐標作圖，直線的斜率為Km/Vmax，截距為1/Vmax，計算以可溶性淀粉或玉米淀粉為底物時的米氏常數Km、反應常數kcat。

1.3.7 重組蛋白質對玉米淀粉結合率及降解率的測定

用0.5 mL 50 mmol/L MES緩沖液（pH 5.0）配制玉米淀粉溶液（其中玉米淀粉質量分別為0、25、50、75、100、125、150 mg），分別向玉米淀粉溶液中加入50 μL 60 μmol/L的重組蛋白質，混合體系在20 ℃恒溫振蕩培養箱孵育3 h，振蕩速率為180 r/min。待孵育結束后，將反應液于12 000×g離心10 min，分別收獲沉淀和上清液，然后采用Bradford法測定上清液中重組蛋白質的質量濃度。結合率計算如式（1）所示：

式中：R為上清液中重組蛋白質質量；O為初始重組蛋白質質量。

取30 g/100 mL玉米淀粉的50 mmol/L MES緩沖液（pH 5.0）與0.1 U/mg（以淀粉質量計）的酶液混合，于60 ℃反應3 h后，用DNS法測定上清液中還原糖量。玉米淀粉降解率如式（2）所示：

1.3.8 CTD對玉米淀粉結合能力的測定

取30 g/100 mL生玉米淀粉的50 mmol/L MES（pH 5.0）緩沖液與30 μg的CTD混合，混合體系在20 ℃的恒溫振蕩培養箱孵育3 h，振蕩速率為180 r/min。孵育結束后，12 000×g離心10 min，獲得沉淀和上清液，用于SDS-PAGE檢測。

1.3.9 玉米淀粉的掃描電鏡觀察

取5 g/100 mL玉米淀粉的50 mmol/L MES（pH 5.0）緩沖液與0.1 U/mg（以淀粉質量計）的酶液混合，于60 ℃反應3 h后，12 000×g離心10 min，獲得沉淀。用無水乙醇洗滌沉淀3 次后，將沉淀置于玻璃器皿中自然風干。使用離子濺射儀Ion Sputter E-1010于5.0 kV和20 mA的條件下處理淀粉顆粒噴40 s，使淀粉顆粒表面鍍Pt，然后采用VEGA3-TESCAN掃描電鏡觀察和拍照。

1.4 數據處理

生淀粉α-淀粉酶的酶學性質研究中，每個實驗做3 個平行。運用軟件SigmaPlot 12.5對實驗數據進行統計分析并作圖，數據均以±s表示。

2 結果與分析

2.1 Gt-amy的結構域和序列分析

圖 1 Gt-amy的三級結構顯示圖Fig. 1 Tertiary structure of Gt-amy

如圖1所示，Gt-amy的三級結構由3 個結構域組成，即結構域A（Ala35～Asp139和Asp241～Tyr430）、結 構 域B （ H i s 1 4 0 ～A s n 2 4 0 ） 和 結 構 域C（Gly431～Phe549）。采用NCBI的在線軟件CDD對 Gt-amy的蛋白質序列進行相似性分析和結構域預測，結果顯示Gt-amy中不存在可能的SBD。同時保守結構域搜索結果顯示Gt-amy的CTD（Lys470～Phe549）為未知功能結構域（domain of unknown function，DUF1939，CDD286264）。由圖1可以看出，CTD由β片層結構組成，CTD的結構特點與B型CBM的結構特點相符。但是CTD與來源于不同CBM家族（CBM20、CBM25、CBM26、CBM41、CBM48、CBM69）的SBD序列以及一些α-淀粉酶結構域C的系統進化關系（圖2）顯示，CTD與來源于Bacillus licheniformis的α-淀粉酶BLA結構域C的進化關系最近，CTD與其他SBD序列的進化關系較遠。并且CTD與SBD的序列比對結果顯示CTD與已知的SBD無明顯序列相似性（結果未顯示）。以上結果表明，CTD不屬于典型的SBD，由結構域和序列分析無法預測CTD的功能。因此，本研究通過對Gt-amy CTD進行缺失突變，并比較Gt-amy與CTD缺失突變體Gt-amy-T對生淀粉的結合能力和降解能力確定CTD的功能。

圖 2 CTD的系統進化分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of the CTD of Gt-amy

2.2 重組蛋白質Gt-amy、Gt-amy-T及CTD的表達與純化

圖 3 重組蛋白質結構模式圖及SDS-PAGE圖Fig. 3 Schematic representation and SDS-PAGE analysis of the recombinant proteins

重組蛋白質的表達與純化結果如圖3所示。目的蛋白質Gt-amy、Gt-amy-T以及CTD均得到成功表達，且主要位于細胞可溶成分中。采用Ni2+親和層析柱對重組細胞可溶成分中的目的蛋白質進行純化，得到純化后的重組蛋白質Gt-amy、Gt-amy-T以及CTD。Gt-amy、Gt-amy-T和CTD的表觀分子質量分別約為56、47、9 kDa，三者的大小均與理論值相符。

2.3 重組蛋白質Gt-amy、Gt-amy-T及CTD對玉米淀粉的結合率和降解率

圖 4 CTD對玉米淀粉結合率（A）及降解率（B）的影響Fig. 4 Effect of the CTD on raw corn starch adsorption (A) and hydrolysis (B)

為研究CTD對Gt-amy結合玉米淀粉的影響，本研究比較了重組蛋白質Gt-amy、Gt-amy-T及CTD對玉米淀粉的結合率，結果如圖4A所示。隨著反應體系中玉米淀粉質量濃度的提高，Gt-amy及CTD對玉米淀粉的結合率也逐漸提高，而Gt-amy-T不能結合玉米淀粉。當反應體系中玉米淀粉質量濃度達到30 g/100 mL時，Gt-amy及CTD對玉米淀粉的結合率達到最高，其中Gt-amy對玉米淀粉的結合率為78.8%，CTD對玉米淀粉的結合率為84.5%。在玉米淀粉質量濃度為0～30 g/100 mL范圍內，CTD對玉米淀粉的結合率均高于Gt-amy，這可能是由于CTD是小分子蛋白質，與Gt-amy相比，CTD更易與玉米淀粉顆粒結合。

以上研究結果表明，CTD具有結合玉米淀粉的能力，并且CTD介導Gt-amy結合玉米淀粉。對于含有SBD或生淀粉結合結構區域的生淀粉酶，缺失該結構會影響生淀粉酶的生淀粉結合率。但該區域的缺失對不同淀粉酶的生淀粉降解率的影響不同。例如，對于來源于L. amylovorus的α-淀粉酶[23]以及來源于G.thermolovorans的α-淀粉酶Gt-amyII[24]，SBD缺失突變體或CTD缺失突變體完全喪失了降解生淀粉的能力。對于來源于Bacteroides thetaiotaomicron的α-淀粉酶SusG，其SBD缺失突變體對生淀粉的比酶活力約為SusG的30%[25]。而對于來源于Bacillussp. TS-23的α-淀粉酶[26]和來源于Thermoanaerobacter ethanolicus39E的淀粉普魯蘭酶[27]，SBD的缺失不影響其生淀粉降解能力。這說明對于一些淀粉酶，其生淀粉結合域并不是降解生淀粉所必需的。已有研究表明，生淀粉α-淀粉酶的結構域C參與生淀粉的結合，例如結構域C of barely α-amylase[28]，結構域C of Gt-amyII[24]。此外，來源于B. licheniformis的 α-淀粉酶BLA已被證實可有效降解玉米淀粉[29-30]，其結構域C與Gt-amy CTD進化關系較近（圖2），BLA的結構域C中是否也結合生淀粉則有待證實。另外，一些特殊的生淀粉酶不含有生淀粉結合域，卻可以降解生淀粉，可能原因是其分子結構中存在生淀粉結合位點[31]。

為研究CTD對Gt-amy降解玉米淀粉的影響，比較 Gt-amy及Gt-amy-T對30 g/100 mL玉米淀粉的降解率。考慮到玉米淀粉的糊化開始溫度為64 ℃，將反應體系置于60 ℃進行反應。由圖4B可以看出，Gt-amy和Gt-amy-T對玉米淀粉的降解率隨時間的延長而提高。當反應時間達到3 h，Gt-amy對玉米淀粉的降解率為65.8%；而 Gt-amy-T對玉米淀粉的降解率僅為2.8%。此外，掃描電鏡觀察結果（圖5）顯示，經Gt-amy處理后的玉米淀粉可觀察到明顯的被降解現象；而經Gt-amy-T處理后的玉米淀粉則無明顯變化。以上研究結果均表明，Gt-amy可有效酶解玉米淀粉，Gt-amy-T不能酶解玉米淀粉。這說明CTD在Gt-amy酶解玉米淀粉過程中發揮重要作用。

圖 5 玉米淀粉的掃描電鏡圖Fig. 5 SEM images of raw corn starch before and after enzymatic hydrolysis at 60 ℃ for 3 h

綜合以上研究結果，Gt-amy可有效地結合和降解玉米淀粉，而其CTD缺失突變體Gt-amy-T不能結合和降解玉米淀粉。這表明，雖然CTD不屬于典型的SBD，但是CTD在Gt-amy結合和酶解玉米淀粉中發揮重要作用。

2.4 CTD中生淀粉結合位點的確定

圖 6 生淀粉結合位點突變體對玉米淀粉的結合Fig. 6 Corn starch binding capacities of raw starch binding site mutants

Gt-amy CTD可有效結合玉米淀粉，CTD中可能存在生淀粉結合位點。目前已知的SBD中參與生淀粉結合的芳香族氨基酸殘基均為色氨酸。為確定CTD中生淀粉結合位點，將CTD中色氨酸殘基Tyr定點突變為丙氨酸殘基Ala，并比較CTD與W→A定點突變體對玉米淀粉的結合。根據QuikChange?點突變試劑盒的原理，構建CTD的W→A定點突變體W471A、W501A、W514A、W526A、W533A、W540A、W548A，在枯草芽孢桿菌表達系統中表達各突變體，并采用Ni2+親和層析純化各突變體。如圖6所示，與CTD相比，突變體W526A和W540A對玉米淀粉的結合率基本不變，突變體W471A、W533A及W548A對玉米淀粉的結合率略有下降，突變體W501A和W514A對玉米淀粉的結合率明顯降低。在此基礎上，本研究構建雙位點突變體W501A/W514A，并檢測該突變體對玉米淀粉的結合。如圖6所示，突變體W501A/W514A對玉米淀粉的結合率顯著下降。根據以上研究結果，可以確定CTD中W501和W514可能是生淀粉結合位點。

2.5 重組蛋白質Gt-amy及Gt-amy W501A/W514A對玉米淀粉的結合率和降解率

圖 7 Gt-amy及突變體Gt-amy W501A/W514A的SDS-PAGE圖Fig. 7 SDS-PAGE analysis of Gt-amy and Gt-amy W501A/W514A

圖 8 生淀粉結合位點對玉米淀粉結合率（A）及降解率（B）的影響Fig. 8 Effect of raw starch-binding site on raw corn starch adsorption (A) and hydrolysis (B)

圖 9 玉米淀粉的掃描電鏡圖Fig. 9 SEM images of raw corn starch before and after enzymatic hydrolysis at 60 ℃ for 3 h

為確定生淀粉結合位點W501及W514對Gt-amy結合和降解玉米淀粉的影響，構建突變體Gt-amy W501A/W514A，對Gt-amy W501A/W514A進行表達與純化 （圖7），并比較Gt-amy及Gt-amy W501A/W514A對玉米淀粉的結合率和降解率（圖8）。與Gt-amy相比，Gtamy W501A/W514A對玉米淀粉的結合率和降解率均明顯降低。其中，當玉米淀粉質量濃度達到30 g/100 mL時，Gt-amy W501A/W514A對玉米淀粉的結合率為8.5%，約為Gt-amy的10.8%；當反應時間達到180 min時， Gt-amy W501A/W514A對玉米淀粉的降解率為25.8%，約為Gt-amy的39.2%。此外，從玉米淀粉的掃描電鏡圖 （圖9）也可以看出，Gt-amy及Gt-amy W501A/W514A均可降解玉米淀粉，但是經Gt-amy處理后的玉米淀粉殘留量較經Gt-amy W501A/W514A處理后的玉米淀粉殘留量明顯偏少，這表明Gt-amy W501A/W514A對玉米淀粉的降解率明顯降低。以上結果表明，對Gt-amy CTD中生淀粉結合位點W501和W514進行突變，影響Gt-amy對玉米淀粉的結合和酶解。

2.6 CTD和生淀粉結合位點W501、W514對Gt-amy催化活性的影響

比較Gt-amy、CTD缺失突變體Gt-amy-T以及生淀粉結合位點突變體Gt-amy W501A/W514A對可溶性淀粉和玉米淀粉的動力學常數，以此確定CTD和生淀粉結合位點W501、W514對Gt-amy催化活性的影響。從表2可以看出，以可溶性淀粉為底物時，與Gt-amy相比， Gt-amy-T對可溶性淀粉的Km未明顯改變，kcat值明顯降低，即Gt-amy-T的可溶性淀粉結合能力未明顯改變，以可溶性淀粉為底物時的反應速率明顯下降，約為Gt-amy的77.9%；Gt-amy W501A/W514A對可溶性淀粉的Km及kcat值均未明顯改變。以玉米淀粉為底物時，與Gt-amy相比，Gt-amy-T不能酶解玉米淀粉；Gt-amy W501A/W514A對玉米淀粉的Km提高至約4.2 倍，kcat值降低了55%，即Gt-amy W501A/W514A的玉米淀粉結合能力明顯降低，以玉米淀粉為底物時的反應速率也明顯降低。以上研究結果表明，CTD的缺失突變不僅導致Gt-amy喪失酶解生淀粉的能力，還使其對可溶性淀粉的降解能力下降；生淀粉結合位點W501、W514的突變不影響Gt-amy對可溶性淀粉的催化活性，但影響Gt-amy對玉米淀粉的結合和酶解。

表 2 重組α-淀粉酶的動力學常數Table 2 Kinetic parameters of recombinant α-amylase

據文獻報道，α-淀粉酶AmyP的SBD對其可溶性淀粉酶活影響顯著，SBD缺失突變體AmyPΔSBD的可溶性淀粉酶活下降了80%[32]。本研究CTD缺失突變體 Gt-amy-T的可溶性淀粉酶活力也低于Gt-amy。也有研究表明SBD的缺失不影響一些生淀粉酶的可溶性淀粉酶活力，如來源于Bacillussp. TS-23的α-淀粉酶[26]和來源于T. ethanolicus39E的淀粉普魯蘭酶[27]。此外，SBD的缺失有利于提高一些生淀粉酶的可溶性淀粉酶活力，如來源于B. thetaiotaomicron的α-淀粉酶SusG[25]和來源于Bacillussp. 195的α-淀粉酶[33]。SBD或生淀粉結合結構區域對淀粉酶的可溶性淀粉酶活力產生不同影響，可能原因是該結構的缺失導致酶分子結構發生了不同的變化。

3 結 論

本研究通過分析Gt-amy、CTD缺失突變體Gt-amy-T和生淀粉結合位點突變體Gt-amy W501A/W514A的玉米淀粉結合率和降解率，確定了CTD的功能和CTD中生淀粉結合位點。CTD屬于生淀粉結合結構域，在Gt-amy結合和酶解生淀粉中發揮重要作用，并且CTD影響Gt-amy的可溶性淀粉酶活力，CTD有利于Gt-amy發揮可溶性淀粉酶活力；CTD中氨基酸位點W501和W514可能是生淀粉結合位點，參與生淀粉結合。Gt-amy CTD不屬于典型的SBD，卻具有生淀粉結合能力，并對Gt-amy的酶學性質產生影響。本研究不僅拓展了對生淀粉結合結構域的結構和功能的了解，也為其他α-淀粉酶的酶學性質優化提供新的理論依據和設計思路。