廣譜抑菌乳酸菌的篩選及其細菌素相關(guān)基因分析

劉樹昕，吳愛娟，甄 妮，孫 潔，黃 苓，曾志丹，曾小群，潘道東

（農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室，浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點實驗室，寧波大學食品與藥學學院，浙江 寧波 315800）

乳酸菌作為一種益生菌，廣泛應用于食品發(fā)酵行業(yè)，能改善產(chǎn)品風味和口感。由于具有黏附特性，可以在腸道中定植，促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，維持腸道菌群的穩(wěn)定[1]。利用乳酸菌的廣譜抑菌特性，能抑制腐敗菌及食源性致病菌的繁殖，延長食品保藏期，所以在食品保鮮及動物飼料等方面有廣泛的應用[2]。

乳酸菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)細菌素更是成為研究和關(guān)注的焦點[3]。細菌素是核糖體上合成的一類抗菌蛋白或多肽，可以被蛋白酶分解，對機體很安全，不產(chǎn)生抗性，同時對自身產(chǎn)生菌有免疫活性，因此細菌素可作為天然防腐劑[4]。抗生素是使用最廣的抑菌物質(zhì)，長期大量使用會導致機體產(chǎn)生耐藥性，作為抑菌物質(zhì)細菌素是抗生素最有潛力的替代物[5]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的細菌素種類繁多，根據(jù)其不同特征，可分為4 類[6]。I類細菌素含有特殊羊毛硫氨基酸的修飾肽，包含19～50 個氨基酸，最典型的是乳酸鏈球菌素（Nisin）[7]。II類細菌素是一類對熱穩(wěn)定的非修飾多肽，分子質(zhì)量＜10 kDa，分為IIa、IIb、IIc三個亞類，研究最多的是IIa類片球菌素。其N端含有一段特殊-YGNGVxCxxxxC-（x表示氨基酸易突變點）的保守序列，這類細菌素對單核細胞性李斯特菌有明顯的抑制活性，如Pediocin PA-1、Pediocin AcH[8-9]。IIb類是雙肽細菌素，當兩肽共同作用時才發(fā)揮較強的抑菌性，如Lactococcin G、Plantaricin NC8[10-11]。IIc類是一種硫醇激活肽，只在含有還原性半胱氨酸殘基才具有活性，如Lactococcin B[12]，III類細菌素對熱不穩(wěn)定，分子質(zhì)量大于30 kDa，如Helveticin I、Enterolysin[13]。IV為復合型大分子細菌素，通常需要與蛋白、碳水化合物及脂質(zhì)相互協(xié)調(diào)才能發(fā)揮抑菌活性，如Leucocin S[14]。由于乳酸菌的種類繁多，產(chǎn)生的細菌素種類各異，且細菌素產(chǎn)量低，分離純化過程復雜繁瑣，導致投入商業(yè)生產(chǎn)的成本高，目前只有極少數(shù)細菌素，如Nisin、Pediocin PA-1等形成了規(guī)模較大的產(chǎn)業(yè)鏈，所以篩選更多產(chǎn)細菌素的乳酸菌具有重要價值[15]。

結(jié)合聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)使產(chǎn)細菌素乳酸菌的篩選更加快速準確，根據(jù)已報道的細菌素相關(guān)基因包括結(jié)構(gòu)基因、負責調(diào)控、轉(zhuǎn)運、免疫的基因設計特異性引物，比較編碼細菌素基因的差異，從而可熟悉掌握所產(chǎn)細菌素的種類及合成途徑[16-17]。Sáenz等[18]從篩選的33 種植物乳桿菌，比較不同植物乳桿菌素pln基因座，對其中27 個基因進行PCR特異性擴增，將PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與已發(fā)現(xiàn)的pln基因簇比對，結(jié)果可分為7 類，同類乳酸菌之間細菌素相似度大于89%。通過PCR技術(shù)可以初步了解細菌素合成及作用機制，為后續(xù)深入探索提高細菌素產(chǎn)量的方法提供理論基礎。本研究將從新疆傳統(tǒng)酸奶中篩選出具有廣譜抑菌效果的乳酸菌，通過PCR擴增技術(shù)對其合成細菌素相關(guān)基因進行分析，以判斷所產(chǎn)細菌素的種類及特征，為細菌素的分離純化、作用方式及其功能應用的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

乳酸菌：分離自新疆地區(qū)牧民自制的酸奶，H1、RA3、RA4、RB1、RC4、RC5、B6、F1均保存于寧波大學食品與藥學學院畜產(chǎn)品加工實驗室[19]。

指示菌：單核細胞性李斯特菌（L i s t e r i a monocytogenesATCC19115）、大腸桿菌（Escherichia coliATCC25922）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescensATCC17400）、鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimuriumATCC13311）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus），均保存于寧波大學食品與藥學學院畜產(chǎn)品加工實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、NB肉湯培養(yǎng)基、BHI液體培養(yǎng)基、PALCAM固體培養(yǎng)基 杭州微生物試劑有限公司； 細菌DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、牛津杯（直 徑6 mm） 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

QHZ-12A型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 江蘇盛藍儀器制造有限公司；Multigene Thermal Cycler PCR儀 美國 Labnet公司；Universal HoodII型凝膠成像分析系統(tǒng) 美國 Bio-Rad公司；LDZX-50KBS型高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；TH-YJ-1450A/B型凈化工作臺 蘇州華科凈化設備有限公司；Centerifuge 5415R型臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；GT16-3M型迷你離心機 杭州米歐儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高效抑菌活性乳酸菌的篩選

實驗菌株經(jīng)活化3 代后，以1%的接種量加入MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取發(fā)酵上清液。采用瓊脂擴散法[20]，分別向平皿底部倒入15 mL LB瓊脂，放上牛津杯，向平皿中分別緩慢倒入10 mL混有106CFU/mL指示菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌）的0.8% LB瓊脂，待冷卻拔出牛津杯，向孔內(nèi)加入100 μL發(fā)酵上清液。4 ℃靜置3 h，于37 ℃培養(yǎng)過夜。孔內(nèi)加入無菌的MRS肉湯作為對照組，測抑菌圈直徑。

1.3.2 抑菌譜測定

為驗證篩選出的乳酸菌是否具有廣譜抑菌性，除以上述4 種指示菌外，還分別以熒光假單胞菌、單核細胞性李斯特菌、鼠傷寒沙門菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌為指示菌進行抑菌實驗，方法同1.3.1節(jié)。

1.3.3 菌種鑒定

1.3.3.1 形態(tài)學及生理生化鑒定

目標菌株在固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)，菌液經(jīng)革蘭氏染色后，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。根據(jù)文獻[21-22]，生理生化實驗包括：D-葡萄糖、蔗糖、鼠李糖、甘露糖、麥芽糖、半乳糖、乳糖核糖、甘露醇、棉籽糖的糖醇發(fā)酵實驗；H2S實驗、V-P實驗、精氨酸產(chǎn)氨實驗、淀粉水解實驗、明膠液化實驗、硝酸鹽還原實驗、接觸酶實驗、吲哚實驗、尿素實驗。

1.3.3.2 菌株B6的16S rDNA分析

使用細菌試劑盒提取D N A ， 以通用引物F（5’-A G A G T T T G AT C C T G G C T C A G-3’）、 R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進行PCR擴增。PCR體系：10 μmol/L上下游引物各2 μL；1 μL DNA模板；25 μL Taq酶；加ddH2O補足50 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，72 ℃延伸10 min，共30 個循環(huán)。通過瓊脂糖核酸電泳對PCR產(chǎn)物進行驗證。將PCR產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果于NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，采用軟件MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的親緣關(guān)系。

1.3.4 產(chǎn)細菌素的初步驗證

乳酸菌的代謝產(chǎn)物中包含多種有抑菌效果的物質(zhì)，除有機酸、過氧化氫外，還有其他的抑菌物質(zhì)。為驗證該菌是否能產(chǎn)細菌素，需排除酸和過氧化氫的影響，并做蛋白酶敏感實驗。以蠟樣芽孢桿菌為指示菌，經(jīng)排除酸及過氧化氫，蛋白酶敏感實驗后進行抑菌實驗。抑菌實驗按1.3.1節(jié)方法。

1.3.4.1 排除酸實驗

接種1%的活化菌液于100 mL的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)30 h，8 000 r/min、4 ℃離心10 min取發(fā)酵上清液，由于酸的抑菌效果最明顯，排除酸后產(chǎn)生的其他物質(zhì)含量少，抑菌效果不顯著，所以將上清液進行冷凍干燥濃縮，濃縮物用20 mL無菌水復溶，用5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 6.5～7.0中性。采用瓊脂擴散法，向孔加入中和前后的上清液100 μL，4 ℃靜置3 h，于37 ℃培養(yǎng)12 h比較兩者的抑菌圈大小。設相同pH值的MRS肉湯為對照組。

1.3.4.2 排除過氧化氫實驗

將過氧化氫酶用50 mmol/L（pH 7.0）的磷酸鹽緩沖液溶解，加入1.3.4.1節(jié)調(diào)節(jié)pH 6.5～7.0的發(fā)酵液中，使過氧化氫酶終質(zhì)量濃度均為5 mg/mL，于37 ℃水浴2 h后，取100 μL加入孔中，4 ℃靜置3 h，于37 ℃培養(yǎng)12 h測量抑菌圈。對照組為未經(jīng)處理的發(fā)酵上清液。

1.3.4.3 蛋白酶敏感實驗

分別用50 mmol/L （pH 7.0）的磷酸鹽緩沖液溶解適量的蛋白酶K、胰蛋白酶以及胃蛋白酶，分別加入經(jīng)1.3.4.1、1.3.4.2節(jié)處理的上清液中，各蛋白酶終質(zhì)量濃度均為1 mg/mL，分別調(diào)整為各酶的最適pH值，37 ℃水浴2 h后調(diào)回pH 6.5～7.0。取100 μL加入孔中。對照組為未經(jīng)各種酶處理的發(fā)酵上清液。

1.3.5 合成細菌素相關(guān)基因的克隆

PCR快速擴增：從NCBI數(shù)據(jù)庫中找出已報道分別從植物乳桿菌C11、NC8、V90、J23、J51、WCFS1、423編碼細菌素合成基因，設計特異性引物[23]（表1）進行PCR擴增驗證。

表 1 細菌素相關(guān)基因PCR擴增引物Table 1 Specific PCR primers for genes involved in bacteriocin biosynthesis

各基因的PCR體系：各2 μL的10 μmol/L上下游引物；1 μL DNA模板；25 μL Taq酶；加ddH2O補足50 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，72 ℃延伸10 min，共30 個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖核酸電泳進行檢測。將與預期大小片段相符的條帶割膠回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中編碼這個基因的序列使用軟件DNAMAN進行序列比對分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表分析

采用SAS（Statistical Analysis System for Windows V8） 軟件對結(jié)果進行差異顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。采用Office軟件進行圖和表格的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效抑菌活性乳酸菌的篩選

如表2所示，8 株菌對4 種指示菌均有抑制效果，其中以B6的抑菌效果最好。8 株菌中除H1外，其余菌株對大腸桿菌均有顯著的抑菌效果，其中以B6和F1最好。對金黃色葡萄球菌，B6的抑菌效果顯著好于F1、H1、RA3、RB1及RC5，與RA4和RC4雖無顯著差異，但抑菌圈直徑均大于RA4和RC4。對枯草芽孢桿菌，除RC4和RC5以外，B6與其他幾株菌均有較好的抑菌效果差異不顯著，以B6的抑菌圈最大。對蠟樣芽孢桿菌，B6的抑菌圈直徑最大，差異顯著，與RB1、RC4及RC5差異雖不顯著，但均高于這幾株菌。B6對其中兩種指示菌金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌效果最好，對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌也有較好的抑菌效果。所以篩選B6做后續(xù)實驗。

表 2 8 種乳酸菌的抑菌效果抑菌圈直徑Table 2 Antimicrobial effects of 8 strains of lactic acid bacteria mm

2.2 菌株B6抑菌譜

菌株B6不僅對革蘭氏陽性菌如單核細胞性李斯特菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌有抑制作用，對革蘭氏陰性菌熒光假單胞菌、鼠傷寒沙門菌、大腸桿菌抑制效果也很突出，尤其是抑制致病菌如金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門菌、單核細胞性李斯特菌和熒光假單胞菌的效果顯著（表3）。

表 3 菌株B6的抑菌譜Table 3 Antibacterial spectrum of strain B6

2.3 菌種鑒定結(jié)果

2.3.1 菌體形態(tài)

通過革蘭氏染色后，在顯微鏡下觀察結(jié)果如圖1所示，B6為短桿狀的革蘭氏陽性菌。

圖 1 B6菌體顯微鏡觀察形態(tài)（×1 000）Fig. 1 Microscopic observation of B6 (× 1 000)

2.3.2 生理生化鑒定

生理生化結(jié)果顯示，B6能利用D-葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、核糖、甘露糖、甘露醇、麥芽糖、棉籽糖。觸酶實驗、吲哚實驗陰性、硝酸鹽還原實驗及明膠液化實驗呈陰性，且不運動性，不產(chǎn)H2S。鑒定B6為植物乳桿菌。

2.3.3 16S rDNA序列比對鑒定

B6的16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖核酸電泳檢測，得到一條約1 500 bp的條帶，與預期結(jié)果相符。將產(chǎn)物測序結(jié)果與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)與植物乳桿菌的相似度為99%。使用MEGA 7.0構(gòu)建菌株B6的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），菌株B6與植物乳桿菌處于同一分支。鑒定B6為植物乳桿菌，分子生物學鑒定結(jié)果與生理生化鑒定結(jié)果一致。

圖 2 菌株B6基于16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of strain B6 based on 16S rDNA gene sequences

2.4 產(chǎn)細菌素的初步驗證

表 4 不同處理對菌株B6抑菌活性的影響Table 4 Effects of different treatments on antibacterial activity of strain B6

取菌株B6的濃縮發(fā)酵上清液，通過不同的處理，對抑菌活性的影響見表4和圖3。未處理發(fā)酵液抑菌圈明顯。調(diào)pH值中性，抑菌圈明顯變小，加入過氧化氫酶后，仍有抑菌效果。說明除有機酸和過氧化氫外，還有其他的抑菌物質(zhì)。將已調(diào)pH值中性，加過氧化氫酶的濃縮發(fā)酵上清液中分別加入胃蛋白酶、胰蛋白酶以及蛋白酶K后，抑菌活性均喪失。表明該抑菌物質(zhì)對蛋白酶敏感，初步斷定其屬于蛋白質(zhì)。

圖 3 不同處理的B6發(fā)酵液的抑菌活性Fig. 3 Antibacterial activity of cell-free supernatant of B6 after different treatments

2.5 細菌素合成基因的PCR快速鑒定

圖 4 細菌素合成相關(guān)基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 4 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of bacteriocinis-related genes

以菌株B6總DNA為模板，分別使用10 對特異性引物進行PCR擴增，如圖4所示，plnA/E/F/J/K/S//N/Q/W都能擴增出單一條帶，且和預期的片段大小相符。pln423、plNC8IF及plnXY均未能擴增出條帶，它們分別是編碼class IIa細菌素、植物乳桿菌NC8誘導肽和植物乳桿菌WCFS1中細菌素合成蛋白的基因。plnEF、plnJK是兩對編碼雙肽細菌的基因，plnA編碼誘導肽，位于調(diào)控操縱子上，plnS位于轉(zhuǎn)運操縱子上，負責細菌素分泌，plnW是編碼膜蛋白，plnN編碼類細菌素，plnQ與植物乳桿菌C11中開放閱讀框orf 1序列一致[24]。它們都在合成細菌素過程中起重要作用。

從圖5可以看出，菌株B6的plnJ基因與植物乳桿菌C11相比，在第10個堿基出現(xiàn)了不同，氨基酸由天冬酰胺替換成天冬氨酸，相似度為99%。成熟肽序列卻完全相同。而plnK、plnE、plnF擴增的片段與植物乳桿菌C11的3 個基因則完全相同，相似度為100%。表明菌株B6產(chǎn)生的細菌素是class IIb的雙肽細菌素。將PCR擴增結(jié)果與幾種已知細菌素基因簇圖譜結(jié)合進行分析，見圖6。

圖 5 菌株B6與植物乳桿菌C11的plnE/F/J/K核苷酸序列比對分析Fig. 5 Nucleotide sequence alignment of plnE/F/J/K between strain B6 and L. plantarum C11

圖 6 植物乳桿菌pln基因座圖譜Fig. 6 Map of pln locus from L. plantarum

3 討 論

乳酸菌是美國GRAS認證的無公害的有益微生物，已大量投入發(fā)酵食品行業(yè)。我國乳酸菌資源豐富，已有學者從我國傳統(tǒng)食品中篩選出了大量的乳酸菌菌株，有利于我國乳酸菌資源的開發(fā)和利用[25]。本研究對從新疆傳統(tǒng)酸奶中篩選的8 株乳酸菌進行抑菌效果、抑菌譜分析，并檢測鑒定產(chǎn)生的細菌素。結(jié)果表明B6對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及蠟樣芽孢桿菌的抑菌效果最好，并對致病菌熒光假單胞菌、單核細胞性李斯特菌、鼠傷寒沙門菌也均有明顯的抑制作用，具有良好的應用前景。

除乳酸菌代謝產(chǎn)生的酸和過氧化氫外，細菌素作為一種安全有效的抑菌物質(zhì)具有重要的應用前景。瓊脂擴散法是最傳統(tǒng)的鑒定產(chǎn)細菌素菌株的驗證手段，但由于細菌素的產(chǎn)量低，經(jīng)排除酸及過氧化氫后抑菌效果并不顯著，準確度、重復性較差。隨著編碼基因等生物信息的不斷豐富，PCR快速鑒定法篩選產(chǎn)細菌素乳酸菌，不僅節(jié)省了大量時間和工作量，且準確度顯著提高[26]。Macwana等[27]通過已報道的不同種屬乳酸菌素結(jié)構(gòu)基因設計了42 對引物，以目標菌株DNA為模板，通過實時熒光定量PCR，比對序列后發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)3 種新性細菌素的乳酸菌Pediococcus acidilacticiBac3、Lactobacillus sakeiJD1及Lactococcus lactisRP1。Wi?ckowicz等[28]將已報道的編碼細菌素序列按同源性分為5 大類，根據(jù)每類細菌素結(jié)構(gòu)基因的特點設計多對特異性引物，對40 種奶酪基因組中編碼class IIa細菌素基因進行鑒定。張旭等[29]采用瓊脂擴散法篩選出產(chǎn)細菌素乳酸菌Z-JL9，通過PCR法驗證該菌是產(chǎn)多種細菌素的乳酸菌，既包含編碼IIb類細菌素Plantaricin EF、JK的基因，又包含IIc類細菌素Plantaricin A和Plantaricin N的結(jié)構(gòu)基因。實驗證明PCR擴增法可以在產(chǎn)特定細菌素的樣本進行高通量篩選和分析。

本研究利用PCR法成功擴增出菌株B6基因組中細菌素的結(jié)構(gòu)基因plnE/F/J/K，經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)和植物乳桿菌C11中編碼IIb類細菌素結(jié)構(gòu)基因plnE/F/K完全相同，而plnJ在編碼前導肽區(qū)域僅存在1 處堿基不同，成熟肽序列完全一致，其他相關(guān)基因plnA/W/S/N/Q能擴增出預期目的條帶。為了解細菌素合成的信息，將PCR擴增結(jié)果與幾種已知細菌素基因簇圖譜（圖6）結(jié)合進行分析[30]。植物乳桿菌素的產(chǎn)生受3 組分系統(tǒng)調(diào)控，其調(diào)控組分為誘導因子、組氨酸蛋白激酶及反應調(diào)節(jié)子[31]。最常見的2 種合成IIb類細菌素調(diào)控系統(tǒng)分別是植物乳桿菌C11/WCFS1/V90/J51調(diào)控操縱子plnA-plnB-plnCD以及植物乳桿菌NC8/J23調(diào)控操縱子plNC8IF-plNC8HK-plnD[32-34]。本實驗中plnA能擴增出目的條帶，與植物乳桿菌C11中的plnA比對，序列完全相同，而plNC8IF卻沒擴增出條帶，則可推斷B6細菌素合成基因與植物乳桿菌C11/WCFS1/V90/J51相似，但plnXY均未擴增出，表明B6的細菌素基因與植物乳桿菌C11最相似[24]為class IIb雙肽細菌素。

綜上所述，通過PCR快速鑒定法，B6是1 株具有廣譜、高效抑菌性的植物乳桿菌，其產(chǎn)class IIb雙肽細菌素。通過PCR快速鑒定細菌素相關(guān)基因法加快了篩選速度，并且提高了準確度。但快速檢測法也存在一定局限性，因PCR法只是和已報道的細菌素基因進行比對，導致很多新型細菌素無法被發(fā)現(xiàn)，所以該方法還有很大的改善空間，故本研究結(jié)合傳統(tǒng)瓊脂擴散法進行產(chǎn)細菌素實驗驗證。對B6細菌素基因的合成和作用機制以及提高雙肽細菌素產(chǎn)量等研究正在本實驗室進一步開展中。