葡萄糖氧化酶在無孢黑曲霉中的重組 表達及酶學性質

林曉彤，潘 力,2，羅時渝，王 斌,2,

（1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2.廣東省發酵與酶工程重點實驗室，廣東 廣州 510006）

黑曲霉（Aspergillus niger）屬于絲狀真菌的一種，具有旺盛的蛋白表達分泌能力以及強大的繁殖能力，普遍應用于工業重組蛋白、檸檬酸等的生產[1-2]，被廣泛用于重組蛋白的表達[3-5]。黑曲霉被美國美國食品藥品監督管理局認證為GRAS（Generally Regarded as Safe）范圍的安全菌種[6]。

葡萄糖氧化酶（EC 1.1.3.4）是一種氧化還原酶，廣泛分布在自然界的微生物、植物和動物體內。當有氧氣存在時，葡萄糖氧化酶可專一性地催化β-D-葡萄糖，將其分解成葡萄糖酸內酯和過氧化氫[7]。作為一種新型的綠色天然酶制劑，在食品業、醫療醫藥業、釀酒業、畜牧業以及紡織業等領域中應用十分廣泛[8-10]。葡萄糖氧化酶最早發現于20世紀初，之后Muller[11]在黑曲霉的無細胞提取液中首次發現葡萄糖氧化酶，并對其催化機理進行較為深入的研究；Keilin等[12]首次于灰綠青霉（Penicilliumglaucum）中發現葡萄糖氧化酶。顧磊[13]使用畢赤酵母異源表達黑曲霉來源葡萄糖氧化酶，胞外酶活力達到 52 U/mL，同時通過對 HAC1、CNE1、SEC53等轉錄因子的改造，使酶活力達到1 972.9 U/mL，為近年來最高。

隨著對葡萄糖氧化酶工業生產的研究的不斷深入，其產量也不斷提高，周亞鳳等[14]將黑曲霉來源的葡萄糖氧化酶基因轉化畢赤酵母Pichia pastoris GS115，經甲醇誘導發酵3～4 d后酶活力可達30～40 U/mL；母敬郁等[15]用黑曲霉來源葡萄糖氧化酶基因轉化瑞氏木霉，其酶活力達到25 U/mL；Kapat等[16]用重組的釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae表達葡萄糖氧化酶，酶活力達到3.17 U/mg。Gao Zhaowei等[17]采用點青霉F4的葡萄糖氧化酶基因在畢赤酵母GS115中異源表達，發酵葡萄糖氧化酶活力達到615 U/mL；陳楠等[18]在畢赤酵母SMD1168中異源表達黑曲霉PCTC的葡萄糖氧化酶基因，經篩選、產酶條件優化，最高酶活力達到32 U/mL。目前常用的高效表達菌株主要是畢赤酵母的重組改造菌[19]，其通過異源表達黑曲霉來源的葡萄糖氧化酶基因達到很高的酶活力，美國Sigma公司生產的商品葡萄糖氧化酶比活力為266.82 U/mg[20]。但食品級安全的葡萄糖氧化酶工業產能仍比較低，幾種食品級安全菌種都有或多或少的缺點，如黑曲霉宿主同源表達產量普遍較低且雜蛋白過多、釀酒酵母產酶糖基化修飾過多等。

針對黑曲霉本身產量低、雜蛋白多等問題，本課題利用低蛋白背景的無孢黑曲霉SH2及HL1作為宿主，以密碼子優化后的黑曲霉CBS513.88來源goxC基因為基礎，構建2 種啟動子不同的葡萄糖氧化酶表達框，表達黑曲霉來源的葡萄糖氧化酶。通過表型板篩選、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）鑒定和搖瓶發酵確定葡萄糖氧化酶活力最高的轉化子，以期在提高葡萄糖氧化酶產量的同時，為提高食品級安全的葡萄糖氧化酶工業產量提供理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

大腸桿菌（Escherichia coli）Match 1T1感受態購自美國Invitrogen公司；黑曲霉菌株SH-2和HL1由本實驗室改造并保存；PUC57-goxC-opt載體（含密碼子偏好性優化的PCV2-cap基因）由本南京金斯瑞公司合成，表達載體pMD18-TP均由本實驗室構建并保藏。

1.1.2 試劑

所有限制性內切酶（如ApaI）、DNA聚合酶 美國TaKaRa公司；NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit 美國NEB公司；鄰聯茴香胺、辣根過氧化物酶 北京普博欣公司；其他試劑均為國產或進口分析純。

1.1.3 培養基

LB培養基：1%胰蛋白胨，1% NaCl，0.5%酵母提取液；CD培養基：2%葡萄糖，0.3% NaNO3，0.2 % KCl，0.05% MgSO4·7H2O，0.1% KH2PO4，0.001% FeSO4·7H2O，2%瓊脂粉，pH 5.5；發酵培養基：5%玉米淀粉，3%玉米漿，2%豆粕粉。

1.2 儀器與設備

微量移液器、高速冷凍離心機 德國Eppendorf 公司；酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR儀 美國Applied Biosystems公司；AKATA層析儀 美國通用電氣公司；浸入式水平電泳系統 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計

根據PUC57-goxC-opt載體中優化后的葡萄糖氧化酶基因序列設計引物（表1）。引物對goxC1770-F/g o x C 1 8 1 8-R 用于擴增去除信號肽的g o x C 基因（GenBank：XM_001389825.2），引物對PglaA1296-F/Pgla1296-R和Pna2/tpi-F/Pna2/tpisig-R分別擴增糖化酶啟動子和雜合啟動子Pna2/tpi（由淀粉酶amyB基因的啟動子和tpi基因的5’UTR組成），啟動子3’連有糖化酶信號肽，5’具有ApaI酶切位點。

表 1 實驗所用引物Table 1 Sequences of PCR primers used in this study

1.3.2 重組表達質粒的構建

以PUC57-goxC-opt載體為模板，使用特異性引物goxC1770-F和goxC1818-R擴增得到goxC基因，將目的基因goxC、啟動子和改造后的pMD18線性化載體（含有篩選標記pyrG及TglaA）通過同源片段在NEB HiFi連接酶的作用下連接，轉化大腸桿菌感受態細胞，經Amp抗性篩選，通過菌液電泳驗證質粒大小是否正確，分別得到糖化酶啟動子和雜合啟動子的重組表達載體。經測序驗證后，將構建正確的重組表達載體命名為pMD18-PglaAgoxC和pMD18-Pna2/tpi-goxC，如圖1所示，使用ApaI單酶切線性化。

圖 1 重組表達質粒pMD18-PglaA-goxC和 pMD18-Pna2/tpi-goxC的 構建圖譜Fig. 1 Construction maps of pMD18-PglaA-goxC and pMD18-Pna2/tpi-goxC

1.3.3 重組表達菌株的構建

通過酶解法制備黑曲霉宿主SH2[21]和HL1的原生質體[22]，將線性化的表達載體pMD18-PglaA-goxC與SH2原生質體，pMD18-Pna2/tpi-goxC與HL1原生質體相混合，利用CaCl2-聚乙二醇法誘導轉化[23]，涂布于高滲CD平板上30 ℃恒溫培養。通過鄰聯茴香胺-過氧化物酶法顯色和PCR定位鑒定轉化子，檢測goxC基因是否整合入黑曲霉宿主基因組中，得到重組菌株SH2-goxC和HL1-goxC的陽性轉化子。

1.3.4 重組表達菌株的搖瓶發酵及酶活力檢測

將重組菌株SH2-goxC和HL1-goxC的陽性轉化子接種于液體淀粉發酵培養基中，30 ℃、250 r/min培養，按24 h間隔分別取樣，8 000×g離心5 min，收集上清液。發酵液稀釋至合適的倍數，用鄰聯茴香胺-過氧化物 酶法[24-26]檢測其在540 nm波長處的吸光度，一個標準酶活力單位定義為：在45 ℃和pH 5.5條件下，每分鐘將1 μmol葡萄糖分解為葡萄糖酸內酯和過氧化氫所需 的酶量[27]。

1.3.5 重組表達菌株的50 L發酵罐發酵

將構建的重組菌株SH2-goxC進行50 L發酵罐發酵。玉米淀粉8%，黃豆餅粉2%，玉米漿2%，消泡劑（聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚）0.08%，高溫淀粉酶（40 000 U/g）30 U/g。參數控制為：罐壓0.05～0.06 MPa，初始罐溫34 ℃，初始通風量1～6 m3/h （根據溶氧量調），轉速200～800 r/min（根據溶氧量調），溶氧量前期控制在50%以上，中后期按最大通風量和轉速運轉，降低時補氨維持在pH 4.5。淀粉水解度降至10左右開始補料，之后控制水解度在5～10之間。

1.3.6 重組葡萄糖氧化酶的純化和去糖基化

由于重組葡萄糖氧化酶帶有6×His標簽，故采用鎳柱親和層析純化重組蛋白，重組菌株SH2-goxC經搖瓶培養7 d后，收集上清液用于純化。使用的層析柱為HisTrapTMHP，上樣量為30 mL，采用梯度洗脫法（咪唑濃度0～0.5 mol/L），流速為2.0 mL/min。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測純化效果。同時用肽N-糖苷酶F去糖基化，再用SDS-PAGE檢測。

1.3.7 重組葡萄糖氧化酶酶學特性分析

最適溫度和pH值測定：在pH 5.5條件下，設置不同溫度梯度25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃測定酶活力隨溫度的變化；在測得的最適反應溫度條件下，測定不同pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）條件下的酶活力，以最適pH值條件下所得的酶活為100%。

在最適溫度或pH值下酶活力隨保溫時間變化的關系：pH 5.5條件下，測在最適溫度條件下保溫0、1、2、3、4、5、6、7、8 h后酶液的酶活力，以保溫時間0 h的酶活力為100%；最適溫度條件下，將葡萄糖氧化酶置于最適pH值緩沖溶液中，測定最適溫度下保存0、1、2、3、4、5、6、7、8 h后的酶活力，以保溫時間0 h的酶活力為100%。

金屬離子及表面活性劑對葡萄糖氧化酶活性的影響：在標準測定體系中分別加入不同金屬離子及表面活性劑SDS、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）使其終濃度為10、100 mmol/L，測定酶活力，以未經處理組的酶活力為100%。

2 結果與分析

圖 2 pMD18-PglaA-goxC和 pMD18-Pna2/tpi-goxC重組 表達載體轉化子的驗證 Fig. 2 Identification of pMD18-PglaA-goxC and pMD18-Pna2/tpi-goxC vector transformants

2.1 重組表達載體的酶切驗證

pMD18-PglaA-goxC和pMD18-Pna2/tpi-goxC表達載體質粒全長分別為10 112 bp和9 623 bp，隨機挑取陽性大腸桿菌轉化子提取質粒，并用ApaI酶切，瓊脂糖凝膠電泳驗證結果如圖2所示，表明挑取的大腸桿菌轉化子質粒大小正確（圖2a、c）。選取酶切驗證正確（圖2b、d）的菌株送樣至Invitrogen公司測序，確定得到含有正確表達載體的大腸桿菌轉化子。

2.2 重組表達菌株的篩選

圖 3 SH2-goxC和HL1-goxC轉化子鑒定Fig. 3 Identification of SH2-goxC and HL1-goxC transformants

先通過鄰聯茴香胺-過氧化物酶法顯色篩選[28-29]，SH2-goxC顯色轉化子有16 株，HL1-goxC顯色轉化子有5 株，使用篩選標記pyrG（1 398 bp）的擴增引物直接PCR驗證重組子，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR的結果和顯色篩選板如圖3所示，兩種轉化子PCR擴增結果均為陽性，表明goxC基因成功非同源整合到宿主的基因組上。

2.3 重組表達菌株的酶活力檢測結果

挑選重組菌株SH2-goxC中的4 株5、23、26、39號，以及HL1-goxC中的4 株1、4、9、10號搖瓶發酵，每24 h取發酵液上清液測葡萄糖氧化酶活力。重組菌株SH2-goxC在第7天達到最大值，如圖4所示，5號表達株的葡萄糖氧化酶活力最高，可達563.8 U/mL，對照組（即宿主）無酶活力。重組菌株HL1-goxC在第3天達到最大值，如圖4所示，9號表達株的葡萄糖氧化酶活力最高，可達 635.1 U/mL，對照組（即宿主）無酶活力。

圖 4 SH2-goxC和HL1-goxC轉化子酶活力測定Fig. 4 GOD activities of SH2-goxC and HL1-goxC transformants

2.4 重組表達菌株的50 L發酵罐發酵

選取SH2-goxC 5號轉化子進行50 L發酵罐發酵。在搖瓶培養過程中，培養基的供氧不斷減少，并且營養條件也不能保證菌體迅速生長。而發酵罐的連續補料、調節pH值等方式，使菌體可以快速生長。如圖5所示，在179 h時，發酵酶活力達到最大，為1 128 U/mL。

圖 5 SH2-goxC轉化子50 L發酵罐發酵酶活力Fig. 5 GOD activity of SH2-goxC transformant in 50-L fermentor

2.5 重組葡萄糖氧化酶的純化及去糖基化

將發酵液上清液經過親和層析，蛋白純化樣品進行SDS-PAGE鑒定，如圖6a所示。再將純化后的葡萄糖氧化酶樣品做去糖基化，如圖6b所示，去糖基化后的酶樣品與條帶2未做去糖基化處理的酶樣品相比大小降了20 kDa左右，由此可見重組葡萄糖氧化酶是糖蛋白。

圖 6 葡萄糖氧化酶表達的SDS-PAGE檢測結果Fig. 6 SDS-PAGE analysis of the expression of GOD

2.6 葡萄糖氧化酶酶學性質

2.6.1 溫度對純化后重組葡萄糖氧化酶活力的影響

葡萄糖氧化酶在4 5 ℃時酶活力最高，而且在35～50 ℃時酶活力較穩定（圖7a）；將酶液置于最適溫度下測定葡萄糖氧化酶活力，隨著保溫時間的延長，酶活力在0～2 h略微穩定，2 h之后酶活力略微下降，到了3 ～4 h 時趨于穩定，4 h 后急劇下 降（圖7b）。

圖 7 溫度對純化后重組葡萄糖氧化酶活力的影響Fig. 7 Effects of temperature on the activity of purified recombinant GOD

2.6.2 pH值對純化后重組葡萄糖氧化酶活力的影響

葡萄糖氧化酶在pH 5.5時酶活力最高，而且在pH 4.5～5.5時酶活力較穩定（圖8a）；將酶液置于最適pH值下測定葡萄糖氧化酶的酶活力，隨著保溫時間的延長，酶活力在0～2 h略微下降，2 h之后酶活力急劇下降，到了3 h后穩定下降（圖8b）。

圖 8 pH值對純化后重組葡萄糖氧化酶活力的影響Fig. 8 Effects of pH on the activity of purified recombinant GOD

2.6.3 金屬離子及化學試劑對重組酶的影響

圖 9 金屬離子及表面活性劑對葡萄糖氧化酶活力的影響Fig. 9 Effects of metal ions and surfactants on the activity of GOD

圖9表明，在10 mmol/L濃度下，Ni2+、Ca2+、K+、 Zn2+、Mg2+增加葡萄糖氧化酶的活性，其中Ca2+、Zn2+大約能提高葡萄糖氧化酶活力20%，Mg2+大約能提高葡萄糖氧化酶活力25%，Ni2+、K+大約能提高葡萄糖氧化酶活力30%；EDTA、Fe3+對葡萄糖氧化酶活力影響很?。籗DS或Na+明顯降低葡萄糖氧化酶活力。在100 mmol/L濃度下，SDS、Ni2+、K+增加葡萄糖氧化酶活力，提高葡萄糖氧化酶活力30%～50%；EDTA、Na+明顯降低葡萄糖氧化酶活力；Ca2+、Zn2+、Fe3+、Mg2+對葡萄糖氧化酶活力影響很小。Mn2+在10 mmol/L及100 mmol/L濃度下，均對葡萄糖氧化酶活力有較大提升，在10 mmol/L濃度下提高葡萄糖氧化酶活力80%，在100 mmol/L濃度下酶活力達到標準酶活力的270%。

3 討 論

黑曲霉作為重組蛋白表達的重要宿主，具有蛋白分泌量大、可進行蛋白翻譯后修飾及高生物安全性等 優點[30]。本研究通過密碼子優化、信號肽替換，優化黑曲霉CBS513.88來源goxC基因，并分別以糖化酶啟動子和雜合啟動子，glaA糖化酶終止子作為表達載體元件，pyrG為雙向篩選標記，構建葡萄糖氧化酶重組表達載體，經過非同源重組分別轉化黑曲霉SH2和HL1，使葡萄糖氧化酶基因得以高效表達。通過表型板篩選、PCR鑒定選出成功轉化的重組葡萄糖氧化酶菌株，測定發酵上清液的酶活力，選出重組表達酶活力最高的轉化子菌株SH2-goxC 5號和HL1-goxC 9號，分別達到563.8 U/mL和658.3 U/mL，并將SH2-goxC 5號上罐發酵，酶活力最高達到1 128 U/mL，提高了1 倍以上。對重組葡萄糖氧化酶進行親和層析純化，SDS-PAGE鑒定顯示蛋白分子質量大小在80 kDa左右，經過去糖基化驗證得到蛋白分子質量大小為65 kDa左右，表明重組葡萄糖氧化酶具有糖基化位點。同時驗證了溫度、pH值對葡萄糖氧化酶活力的影響，葡萄糖氧化酶在pH 5.5時酶活力最高，而且在pH 4.5～5.5時酶活較穩定；葡萄糖氧化酶在溫度45 ℃時酶活力最高，30～50 ℃時酶活力較穩定。

本研究結果為食品級安全葡萄糖氧化酶的工業發酵表達量的提高提供了理論依據和數據支持。后續可以進一步研究黑曲霉宿主的改造以及葡萄糖氧化酶的定點突變研究，以得到酶活力更高的黑曲霉菌株。